过氧化氢酶活性测定

　　过氧化氢酶(又称触酶)，是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶，其生物学功能是催化细胞内过氧化氢分解为H₂O与O₂，阻抑H₂O₂生成有害的·OH。

　　随着科学技术的发展和社会的进步，过氧化氢酶(CAT)的用途越来越广泛。目前纺织业应用强氧化剂过氧化氢漂白脱色，而多余的过氧化氢可用过氧化氢酶去掉，以符合于环保的要求。医学上也可用低浓度过氧化氢清除坏死组织，然后再用过氧化氢酶反应多余的过氧化氢。葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶复合制剂还可用于FZ动物肠道、胃部由细菌引起的一些疾病。因此过氧化氢酶的酶活力测定对于研究和应用此酶显得十分重要。

　　过氧化氢酶测定方法主要有碘量法、紫外吸收法、荧光分析法、化学发光法、极谱氧电极法、简易气量测定法等，基于过氧化氢易分解，所以直接检测过氧化氢来表示过氧化氢酶活性的测定方法准确度不高。

一、不同植物过氧化氢酶活性

　　(一)材料与方法

　　试验材料选用6种较为普遍种植的叶菜类蔬菜，包括普通叶菜类的香芹、小白菜、红菜苔、上海青;结球叶菜类的包心菜;辛香叶菜类的芫茜。采用紫外分光光度法测定和计算过氧化氢酶活性;将第1天试验后剩余蔬菜置于常温25℃环境下储存至第2天、第3天，提取粗酶液后测定每种蔬菜过氧化氢酶活性的变化。

　　(二)结果与分析

　　1、6种蔬菜不同部位过氧化氢酶活性

　　由下图可知，在相同环境条件处理下，6种蔬菜各个部位的过氧化氢酶活性各有高低，其中Z高的为红菜苔叶，过氧化氢酶活性为219.06U/gFW/min;其次是小白菜叶为199.68U/gFW/min，Z低为芫茜叶为83.43U/gFW/min。各种蔬菜茎的过氧化氢酶活性普遍比其叶的过氧化氢酶活性低，Z高为芫茜茎为66.09U/gFW/min，其次为小白菜茎为41.25U/gFW/min，Z低为红菜苔茎为13.43U/gFW/min。叶与茎过氧化氢酶活性差别Z大的是红菜苔，叶与茎过氧化氢酶活性差别Z小的是芫茜。

　　2、6种蔬菜过氧化氢酶活性随贮藏时间的变化

　　①上海青

　　上海青叶和茎同处上升趋势。上海青叶过氧化氢酶活性从第1天到第2天增幅为24%，第2天到第3天增幅为34.5%;上海青茎过氧化氢酶活性从第1天到第2天的增幅很小，第2天到第3天上升约93.7%，见下图。

　　②小白菜

　　小白菜叶在经历第2天小幅上升后，第3天开始下降，从第2天到第3天下降约18%，小白菜茎过氧化氢酶活性则从第2天开始缓慢下降，到第3天下降幅度继续增大，从第2天到第3天下降约53%，见下图。

　　③香芹

　　香芹叶子的过氧化氢酶活性在第2天下降至59.22U/gFW/min，下降约40%，到第3天继续下降至34.68U/gFW/min，过氧化氢酶活性下降约41%，在2天的贮存期间下降幅度相近，保持稳定的下降趋势，表示叶子在逐渐衰老;香芹茎中过氧化氢酶活性在第2天小幅上升了19%后，至第3天回落，总体呈现逐渐衰老趋势，如下图所示。

　　④芫茜

　　从下图可见，芫茜叶在第2天上升约54%后至第3天缓慢下降;而芫茜茎过氧化氢酶活性则一直处于下降，第2天过氧化氢酶活性已下降到38.28U/gFW/min，第3天经历小幅下降。

　　⑤红菜苔

　　从下图可以得出，红菜苔叶过氧化氢酶活性起点很高，在测定的3天中变化不大，呈缓慢上升趋势;红菜苔茎则在经历了第2天缓慢上升后在第3天上升幅度较大，从第2天到第3天增幅约188%。

　　⑥包菜

　　下图表明，包菜的叶和茎变化曲线相似，呈缓慢上升趋势，包菜叶过氧化氢酶活性3天中增幅为36%;包菜茎从第2天到第3天的过氧化氢酶活性增幅为99%。

　　⑦6种蔬菜叶过氧化氢酶活性变化

　　从下图可知，红菜苔叶、包菜叶、芫茜叶、上海青叶从第1天到第3天的过氧化氢酶活性变化总体为升高的趋势，而小白菜叶、香芹叶由第1天到第3天的过氧化氢酶活性变化总体为下降趋势。

　　⑧6种蔬菜茎过氧化氢酶活性变化

　　由下图得出，芫茜茎、小白菜茎、香芹茎由第1天到第3天的过氧化氢酶活性变化总体为降低趋势。但上海青茎、包菜茎、红菜苔茎从第1天到第3天的过氧化氢酶活性变化总体为上升的趋势。

　　(三)讨论

　　在环境条件相同且常温储藏中，不同的蔬菜因品种的不同过氧化氢酶活性变化不同，大致可分为3种：①逐渐下降;②单峰曲线;③末段上升。因蔬菜Z佳的储存食用期为3天，因此本试验设计的天数也为3天期限。

　　红菜苔、上海青、小白菜都属于普通叶菜类蔬菜，它们的过氧化氢酶活性普遍都较高，因此较耐贮藏;包心菜属于结球类叶菜其过氧化氢酶活性与普通叶菜类蔬菜相当;而芫茜则属于辛香叶菜类，过氧化氢酶活性较其他种叶菜类低，但同样遵循叶比茎的过氧化氢酶活性高的规律。在本试验中符合此特性的有芫茜叶、上海青、红菜苔、包菜。

　　从这些蔬菜的过氧化氢酶变化规律可看出，它们在经历了活性氧失衡的临界点后过氧化氢酶活性才逐步下降并衰老，临界点集中出现在蔬菜采后的第2天、第3天。因此果蔬采后保鲜技术的研究可从如何维持第2天、第3天的活性氧代谢水平方向研究，也可考虑从采后2天或3天的蔬菜中提取高活性过氧化氢酶用作工业用途。

　　蔬菜的叶和茎受逆境影响程度不同，有的蔬菜叶较易受逆境因素激发影响，活性氧在有利范围内增加，如上海青叶、芫茜叶，而有的蔬菜茎较易激发，如红菜苔茎、包菜茎。与别的蔬菜种类比较起来香芹较难贮藏，在普通环境中无任何处理，香芹贮藏就会迅速衰老，而其他蔬菜如上海青、包菜、小白菜即使对它们不作任何保鲜处理，在普通环境中贮藏，其过氧化氢酶活性依然会上升，起到延缓其衰老腐败的作用，使这些蔬菜较易贮藏。

　　(四)结论

　　1、从6种蔬菜的叶和茎两个部位中提取出来的过氧化氢酶活性表明，叶过氧化氢酶活性普遍较高，而茎则普遍较低;各蔬菜之间、品种之间、部位之间活性相差也较大。

　　2、6种蔬菜过氧化氢酶活性随贮藏时间的变化规律，从第1天到第3天的叶与茎过氧化氢酶活性变化总体为升高趋势的有红菜苔叶茎、包菜叶茎、上海青叶茎、芫茜叶;由第1天到第3天的叶与茎过氧化氢酶活性变化总体为下降趋势的有小白菜叶茎、香芹叶茎、芫茜茎。

　　3、蔬菜采后活性氧代谢失衡点普遍出现在第2、3天间，因此只要采取适宜的保鲜措施，即使采后2～3天依然能在一定程度上保持其食用及味道。

二、分光光度法测定植物过氧化氢酶活性

　　(一)材料与方法

　　1、试验仪器：紫外分光光度计;离心机;研钵;容量瓶;吸管;试管;恒温水浴锅。

　　2、试剂：0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液(内含1%聚乙烯吡咯烷酮);0.1 mol/L H₂O₂(用0.1 mol/L高锰酸钾标定)。

　　3、方法：以从小麦叶片中提取的过氧化氢酶活性的测定为例(从豌豆、黄瓜中提取和测定过氯化氢酶活性参照小麦叶片的测定)。

　　①酶液提取：称取新鲜小麦叶片0.5g置研钵中，加入2-3ml 4℃下预冷的pH=7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。

　　②活力测定：取10ml试管3支(S1、S2、S3)，其中(S1、S2)为样品测定管，(S3)为空白管，按下表顺序加入试剂，重复3次。

　　25℃预热后，逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H₂O₂，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

　　③结果计算：以1min内A₂₄₀减少0.1的酶量为1个酶活单位(U)。

　　过氧化氢酶(A)活性(U/gFW/min)=ΔA₂₄₀×V_T/(0.1×V₁×t×FW)

　　A₂₄₀=A_S0﹣(A_S1+A_S2)/2

　　A_S0：加入煮死酶液的对照管吸光值;

　　A_S1，A_S2：样品管吸光值;

　　V_T：粗酶提取液总体积(ml);

　　V₁：测定用粗酶液体积(ml);

　　FW：样品鲜重(g);

　　0.1-A₂₄₀：每下降0.1为1个酶活单位(U);

　　t：加过氧化氢到Z后一次读数时间(min)。

　　(二)结果与分析

　　从小麦叶片、豌豆和黄瓜中提取的过氧化氢酶活性的测定结果见下表。

　　从试验得出的数据可以看到第1分钟得出的结果是从黄瓜中提取的过氧化氢酶的活性Z大，小麦次之，Z后是豌豆。第2分钟、第3分钟、第四分钟得到的结果和第1分钟一样，也是从黄瓜中提取的过氧化氢酶的活性Z大，小麦次之，Z后是豌豆。

　　(三)结论与讨论

　　本试验主要研究从3种植物中，在质量相同的情况下哪种植物可以提取更多的过氧化氢酶。由于这3个反应都是过氧化氢的分解反应，在其他的条件相同的情况下过氧化氢酶的量多的反应速度就快，反应进行的越快则过氧化氢酶的活性就越大。

　　从Z后试验得出的数据可以看到黄瓜中提取的过氧化氢酶的活性Z大，小麦次之，Z后是豌豆。在质量相同的情况下在这3种植物中从黄瓜中可以提取更多的过氧化氢酶，小麦次之，Z后是豌豆。

三、水杨酸法测定植物过氧化氢酶活性

　　(一)材料与方法

　　1、仪器与试剂

　　新鲜的土豆、黄瓜、生菜、苹果、梨，均购于本地华美超市。双氧水30%、硫酸亚铁、水杨酸、石英砂。本实验所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。水样来自实验室自来水。

　　UV-2550紫外可见光谱仪，数显恒温水浴锅。

　　2、实验方法

　　①过氧化氢的标准曲线

　　取6支10mL比色管，分别向其中加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1mL过氧化氢溶液(0.003%)，再向各管内加入1mL pH=1的硫酸、4mL硫酸亚铁溶液(1×10^-3mol/L)、2mL水杨酸溶液(1×10^-2mol/L)，用蒸馏水定容到刻度线，混匀。在40℃水浴锅内保温10分钟后，在波长510nm下测定吸光值，记为A。以过氧化氢的质量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制工作曲线。

　　②酶液的提取

　　称取新鲜被测植物组织0.5g，置于研钵中，加入少量石英砂和2～3mL蒸馏水，充分研磨成匀浆后，转入25mL容量瓶内，并用蒸馏水冲洗数次研钵，合并冲洗液，并定容到刻度线，混匀后放置在5℃冰箱内静置10分钟。在4000r/min下离心15分钟，上清液即为过氧化氢酶粗提液，于5℃冰箱内保存备用。

　　③酶活性测定

　　取4支10mL比色管，分别加入1mL过氧化氢酶粗提液液，在25℃水浴锅内预热10分钟后，逐管加入1mL过氧化氢溶液(0.003%)，在25℃下保温。

　　每隔1分钟取出一支比色管，迅速加入1mL pH=1的硫酸，终止反应。再向管内加入4mL硫酸亚铁溶液和2mL水杨酸溶液，用蒸馏水定容到10mL，混匀，放在40℃水浴锅内保温10分钟。然后在波长510nm下测定吸光值，记为A_S1、A_S2、A_S3、A_S4，对照组不加过氧化氢的其余组分溶液，每隔1min测其吸光度，共测3次，取平均值记为Ab，并计算ΔA(ΔA=A_S-A_b)。

　　④酶活性的计算方法

　　土豆过氧化氢酶的活性计算方法：

　　K_f=k×(25mL/1mL)×(1/0.5g)

　　其中，K_f为过氧化氢酶活性值μg/min;k为ln(X₀/X)，表示植物组织中过氧化氢酶分解过氧化氢的速率;25mL为植物过氧化氢酶粗提液总体积，1mL为反应液中酶液的加入量，0.5g为称取植物组织的质量。

　　3、统计分析

　　实验数据用origin8.0软件处理，并用SPSS17.0软件包进行差异显著性分析(P<0.05)。

　　(二)结果与讨论

　　1、线性关系的考察

　　按标准曲线的方法，求得回归方程和相关系数分别为：y=0.0166x+0.0036，R²=0.9992，过氧化氢浓度在0～33.670μg范围内呈良好的线性关系。

　　2、硫酸亚铁浓度双氧水检测的影响

　　取7支10mL比色管，按酶活性测定的实验方法，保持其它条件不变(1mL过氧化氢溶液、2mL水杨酸溶液、pH=1的硫酸1mL、反应时间为10min、反应温度为40℃)，只改变硫酸亚铁溶液为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5mL，考察硫酸亚铁浓度双氧水检测的影响，见下图。

　　结果表明，在测定羟自由基时，硫酸亚铁的Z佳加入量为4mL。

　　3、水杨酸浓度对双氧水检测的影响

　　取6支10mL比色管，按酶活性测定的实验方法，保持其它条件不变(1mL过氧化氢溶液、4mL硫酸亚铁溶液、pH=1的硫酸1mL、反应时间为10分钟、反应温度为40℃)只改变水杨酸溶液的体积为0.5、1、1.5、2、2.5、3mL，考查水杨酸浓度对双氧水检测的影响，结果如下图。

　　结果表明，在测定羟自由基时，水杨酸溶液的Z佳加入量为2mL。

　　4、pH对双氧水检测的影响

　　取6支10mL比色管，按酶活性测定的实验方法，保持其它条件不变(1mL过氧化氢溶液、4mL硫酸亚铁溶液、2mL水杨酸溶液、反应时间为10分钟、反应温度为40℃)只改变硫酸溶液的pH=1，2，3，4，5，6各1mL考查pH对双氧水检测的影响，结果如下图。

　　结果表明，在测定双氧水时，加入pH=1的硫酸1mL效果Z佳，用pH计测定，pH位1.2，pH=1.0可以终止过氧化氢和过氧化氢酶的方法，本试验选择pH=1.2的硫酸溶液1mL。

　　5、时间对双氧水检测的影响

　　取6支10mL比色管，按酶活性测定的实验方法，保持其它条件不变(1mL过氧化氢溶液、4mL硫酸亚铁溶液、2mL水杨酸溶液、反应温度为40℃)只改变反应时间为2、4、6、8、10、12、15min，考查反应时间对双氧水检测的影响，结果如下图。

　　结果表明，在测定双氧水时，Z佳反应时间为10分钟。

　　6、温度对双氧水检测的影响

　　取6支10mL比色管，按酶活性测定的实验方法，保持其它条件不变(1mL过氧化氢溶液、4mL硫酸亚铁溶液、2mL水杨酸溶液、反应时间为10分钟)只改变反应温度20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃。考查温度对双氧水检测的影响，结果如下图。

　　结果表明，在测定双氧水时，Z佳反应温度为40℃。

　　7、酶活性的测定

　　分别取处理后的样品土豆、黄瓜、生菜、苹果、梨0.5g，按上文的方法提取，加入过氧化氢X₀为33.670μg，按酶活性测定的实验方法测定△A，计算ln(X₀/X)，以时间t为横坐标，ln(X₀/X)为纵坐标作图求的回归方程，根据上文的试验方法计算反应速率k和过氧化氢酶酶活K，实验数据见下表。

　　用紫外分光光度法直接测定土豆、黄瓜、生菜、苹果、梨五种蔬菜水果的过氧化氢酶活性，所得数据分别为4.87±3.5、1.02±3.2、4.21±0.8、1.45±1.5、2.40±6.7μg/min，统计分析表明，过氧化氢酶活没有显著性差异，新方法适用于蔬菜水果中过氧化氢酶活的测定。

　　(三)结论

　　利用水杨酸法测定不同植物中过氧化氢酶活性的新方法，加入硫酸既可以终止过氧化氢酶分解过氧化氢，又满足水杨酸法测定过氧化氢的反应条件，同时简化了反应体系。对五种植物组织中过氧化氢酶进行测定，结果与紫外吸收光谱法比较，无显著性差异，但本法重现性好，检出线低，选择性好，适合于蔬菜水果中过氧化氢酶活的测定。