薄层色谱

一、是什么薄层色谱

1、定义

薄层色谱，英文简称TLC，也叫薄层层析，因分离是在一平面薄层上进行的，得名薄层色谱。薄层色谱是以合适的溶剂为流动相，以涂布于支持板上的支持物作为固定相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。薄层色谱是20世纪40年代末发展起来的一种快速、简便和微量的色谱方法。

2、基本原理

薄层色谱法利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在流动相(溶剂)流过固定相(吸附剂)的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。

吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。

吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。

物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。

例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。

3、薄层色谱法发展历史

1938年，Izmailor和Schraiber在显微镜载玻片上涂布氧化铝薄层，将欲分离的物质点样于薄板上，用毛细管吸取展开剂垂直放于样点ZX，展开剂自毛细管流出，从而成功地分离了多种植物酒精提取物中的成分。

20世纪50年代，K．rehner及Miller等在前人研究的基础上，以硅胶为吸附剂、石膏为黏合剂，将硅胶涂布于玻璃板上制成薄层，并进行物质的分离，这也是现代意义上的薄层色谱法。

二、薄层色谱分类

薄层色谱依据固定相的性质和分离机理的不同，可分为分配薄层法、吸附薄层法、离子交换薄层法等。其中，以吸附薄层法和分配薄层法的应用Z为广泛。

①分配薄层法

分配薄层法以液体为固定相。液体固定相被预先附着在载体(一种多孔的化学惰性固体物质)上，然后涂布固定相制板，点样展开，由于被分析物质各组分在固定相和展开剂之间溶解度不同，即分配系数不同，从而被展开剂携带移动的速度也不同，Z终将不同组分分离。

②吸附薄层法

吸附薄层把固定相(吸附剂)均匀地涂布在表面光滑的薄层板上，把待分析的试样溶液点在薄层板一端的适当位置上，这一过程称为点样，样液点称为原点。然后将薄板放在密闭的展开槽(chamber)里，将点样端浸人适官的溶剂中，借助于薄层板上吸附剂的毛细管作用，溶剂载着被分离组分向前移动，这一过程称为展开(development)，所用溶剂称为展开剂(developing solvent)。展开时，样品中各组分在固定相与展开剂之间发生连续的吸附、解吸、再吸附、再解吸。由于固定相对不同组分的吸附能力不同，易被吸附的组分相对移动得慢，而难被吸附的组分则相对移动快，经过一段时间，当展开剂前沿到达预定位置后，取出薄层板，吸附力不同的组分在薄层板上可形成彼此分离的斑点。如果组分为无色物质，可通过物理或化学方法显色后定位。

③离子交换薄层法

离子交换薄层法以离子交换树脂为固定相，通常将离子交换树脂粉碎成200～40O目，再涂布在玻璃、金属薄板等的表面制成薄层板，点样展开。被测物质的各组分与离子交换树脂进行离子交换，交换能力强的组分先交换，交换能力差的组分被展开剂带走后再交换，从而使不同组分分离。

三、薄层色谱扫描仪

薄层色谱扫描仪是利用薄层色谱原理对试样进行定量检测分析的仪器，当前市场上的薄层色谱扫描仪可分为传统薄层色谱扫描仪和薄层数码成像分析仪两类。

1、传统薄层色谱扫描仪

是一种全波长扫描仪，提供波长200-800nm范围的可选波长，通过检测样品对光的吸收强弱确定物质含量。该扫描仪也能检测254nm或365nm紫外照射产生的荧光强度，从而进行特异性检测。

传统扫描仪的扫描方式分为：单光束扫描、双光束扫描和双波长扫描。

单光束扫描：采用单一光束（即单一波长扫描），其结果就是上图中一特定波长条件下的单条曲线。仪器结构简单，但是基线不稳，实际中很少使用。

双光束扫描：采用同一波长的两个光束同步扫描，一个光束扫描样品展开通道，另一个光束扫描样品通道旁边的空白区域，这样就可扣除空白吸收，部分消除薄层板展开方向铺板不均匀产生的误差。但是无法消除垂至于展开方向铺板不均匀产生的误差。

双波长扫描：两个不同波长的光束交替扫描样品展开的通道区域，波长选择时，一个波长为样品Z大吸收位置，另一是吸收极小值位置。这种方法可基本消除铺板不均产生的误差，因此扫描基线很稳定。

2、薄层数码成像分析仪

薄层数码成像分析技术是利用数码成像设备获得薄层板上各点的光强度信息，之后对获得图像进行分析的薄层分析技术。数码成像设备包括两种：照相机和扫描仪（由于数码扫描仪采用逐行成像技术，为便于区分传统薄层扫描仪的逐点扫描，将数码扫描仪称为逐行扫描仪）。

和传统薄层扫描一样，照相机或逐行扫描仪都具有光检测系统，它们都是将光量线性转化为电信号的元件。不同的是，照相机和逐行扫描仪可进一步将电信号转换成电脑图像，图像中单个点（像素）的颜色深浅反映了光的强弱。

因此，薄层数码成像更接近人眼观察检测，结果更直观，因此非常适合鉴别，特别是中药指纹图谱的识别。

四、薄层色谱的应用

薄层色谱法的优点是设备简单，操作方便，分离效率和检出灵敏度都比较高。它的所有步骤是独立的，方法的灵活性高。薄层板是一次性使用的，和GX液相色谱相比，样品基质对固定相的污染不成为问题，样品的预处理相对较简单。一次可以将多个样品和标准样品同时点样进行展开，因此效率高，单个样品的分析成本低。

1、适合小量样品分离

薄层色谱可适用小量样品（几到几十微克甚至0.01μg）的分离，也可用于多达500mg样品的分离，是近代有机化学中用于定性，定量的一种重要手段。特别适用于那些挥发性小的化合物，以及在高温下易发生化学变化而不能用气相色谱分析的物质。基于这些特点，薄层色谱法在医药、生物、环境、食品等方面有着广泛的应用，例如：用于各种天然和合成有机物的分离和鉴定及小量物质的精制；在药品质量监控中，用于测定药物的纯度和检查降解产物，对中药材和中成药，可鉴别有效成分，进一步进行含量测定；在合成工艺中用作监控分析的手段；还可用于环境有害物质的分析、食品的天然营养成分和食品添加剂及某些真菌毒素如黄曲霉毒素的分析等。

2、应用领域

为消除实验过程中的诸多影响因素，现代薄层色谱基本都是由各种仪器来代替。这也是国内科技发展的大趋势，逐渐取代人为因素在实验过程中的影响，从而达到重现性的效果。

薄层色谱的用途多种多样，在制药、食品、保健品、化妆品、法检、饲料、工业等领域均有较广泛的应用。

3、薄层色谱应用实例：

食品中红曲色素的测定(GB/T 5009.150-2003)。试样中的红曲色素经提取，净化后，薄层分离，与标准样品比较，定性。红曲色素标准品是将1g红曲色素溶于30mL甲醇，通过50g硅胶色谱柱(湿法装柱)纯化，收集甲醇洗脱液，减压浓缩，于60～70℃烘干制得。配制标准使用液0.1 mg/mL。

样品豆腐乳的处理方法：取豆腐乳30g，加95％的乙醇50～70mL，提取回流30min，过滤，收集滤液，减压浓缩至20mL。

点样：取市售预制硅胶GF254板(4cm×20cm)2块，每块在离底边2cm处点试样10uL，左右两边各点2uL标准使用液。分别以展开剂l甲醇，展开剂2正己烷＋乙酸乙醋＋甲醇(5+3+2)，展开至前沿到15cm处，晾干。在UV 254nm下观察，展开剂1得到4个点，Rf值分别为0.86、0.71、0.54、0.38，展开剂2得到3个点，Rf值分别为0.86、0.69、0.57。试样与标准品的斑点的Rf值一致。证明试样的色素为红曲色素。