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凝胶电泳仪是以琼脂糖凝胶作为载体的电泳,广泛用于核酸的研究,为DNA分子及其片段的分子量测定和DNA分子构象分析提供了重要手段。
凝胶电泳仪是用琼脂糖作支持介质的一种电泳仪。其分析原理与其他支持物电泳的Z主要区别是:它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大,对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道,现广泛应用于核酸的研究中。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定。
1、DNA的分子大小
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。
2、琼脂糖浓度
一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3、DNA分子的构象
DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动Z快,而开环双链DNA移动Z慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。
4、电源电压
在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段有效分离所加电压不得超过5V/cm。
5、嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15%。
6、离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率Z小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
琼脂糖凝胶电泳仪是以琼脂糖凝胶作为载体的电泳,广泛用于核酸的研究。琼脂糖凝胶的性能指标有电渗、胶凝温度、熔化温度、凝胶强度和脱水收缩作用等。
1、电渗:
电渗是琼脂糖凝胶电泳中由多糖骨架上的带电基团引起的,主要是由硫酸酯和丙酮酸盐引起,这些阴离子基团被固定在载体中,相应的阳离子与其结合水一起向负极移动。
2、胶凝温度:
将琼脂糖凝胶在溶液中加热至90℃溶解后降温,由液态转变为固态时的温度即为凝固点,称为胶凝温度。一般在35~43℃。
3、熔化温度:
将凝固的琼脂糖凝胶由固态转变为液态时的温度即为熔化点,称为熔化温度。一般在75~90℃。
4、凝胶强度:
凝胶强度是指每平方厘米的琼脂糖凝胶所能承受的重量。凝胶强度与凝胶浓度成正比。
5、脱水收缩作用:
脱水收缩作用是指由于琼脂糖凝胶骨架收缩使一部分液体从凝胶中分离出来的现象。
琼脂糖凝胶是从琼脂中精制出来的白色胶状多糖,是由1,3连接的β-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水β-D吡喃半乳糖交替而成的中性物质。琼脂糖由于氢键和其它力的作用使其相互盘绕成绳状琼脂糖束,而形成大网孔型凝胶。
琼脂是从海藻中提取出来的多糖体,主要由琼脂糖(约占80%)和琼脂胶组成。
琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖,从琼脂胶中脱去硫酸酯基和丙酮酸酯基可获得琼脂糖。琼脂胶和琼脂糖的结构相似,但由于琼脂胶含硫酸根和羧基,凝胶能力差;琼脂糖中存在极微量的硫酸根和丙酮酸酯基取代电离基团,在电场作用下能产生较强的电渗;硫酸根可与某些蛋白质作用,从而影响电泳速度和分离效果。
在琼脂糖凝胶制备过程中需要把琼脂胶尽量除去。质量较好的琼脂糖凝胶的硫酸根含量较低,通常小于0.2%,电渗较小。
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