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芯片检测仪涉及生物芯片检测技术和体外临床检测技术领域,主要用于对化学发光和其他自发光形式的生物芯片反应结果进行检测和分析。芯片检测仪有多种设计类型,但任何类型都有共聚焦激光扫描探测系统及以下基本功能。
激发光:
芯片检测仪激发光应直接射向微阵列上的待测样品,通过大量一次照明的方式,待测样品的大部分区域同时受到激发,这种方式在CCD数码相机中较常见,该方式的缺陷是待测样品受到的激发光不够均匀一致。这点是芯片检测仪设计者须考虑到的重要因素之一。
激发光聚焦于样品的很小部分,采用特定的光线采集和定位,聚焦点上的激发光光线密度较高,大约为10000watt/cm2。芯片检测仪激发光波长的选择是依据染料的激发曲线和释放曲线的峰值来确定的,在染料激发峰值的左边且激发效率较高的范围内,在某种染料水平下,激发效率越低,要达到某种光强,则需要向样品上发射的光越多。过多的发射光将通过光漂白作用破坏样品和污染干扰释放光的信号。
释放光采集:
荧光由目镜的镜头来采集,该镜头聚焦于样品上并将一定区域内的光线收集到装置。收集的角度区域的大小非常关键,荧光释放是球形的,目镜对荧光的采集范围是决定芯片检测仪的采集效率关键指标之一。目镜采集光的角度由数值孔径来表示,数值孔径与光采集效率之间具有一定的变化关系。
当数值孔径为1.0时,目镜将收集到整个半球的光,相应的光采集效率为50%。许多激光共聚焦微阵列芯片检测仪的数值孔径在0.5~0.9,而CCD芯片检测仪的数值孔径为0.2~0.5。
有其他类型的芯片检测仪不用目镜而是使用积分球面镜来采集释放的部分光源,但是部分光线经过多次球面反射而衰减。还有一些无散光收集装置,仅仅是将探测器放在样品的某一区域的上方,光线采集的效率受限于样品被照明处的范围及探测器的视角。
空间定位:
空间定位可通过多元素探测器,如CCD或机械芯片检测仪。许多相机设置为大范围照明,探测器直接提供由许多像素组成的图像,该方法的缺陷是CCD提供的目镜数值口径较小,后方照明及维持系统冷却设备价值昂贵,由于光散射会导致像素之间交叉重叠造成信号不够清晰。
芯片检测仪扫描过程包括以下几个步骤:将激发光束聚焦于某一大小同像素差不多的点上,用单一元素的探测器采集那一小点上的释放光。要将整个样品扫描完全,则需移动样品或用一微小的反光镜使激光束移动扫描样品。虽然扫描装置增加了机械装置的复杂程度,但比起CCD相机来,机械扫描可达到的数值孔径更高,有更好的空间选择性,探测器也较便宜些。在低强度的光源下,高光线采集率是至关重要的。
激发/释放分辨:
微阵列上各点的荧光释放强度通常要比激发光强度弱几个数量级,要从激发光中检测出微弱的荧光信号,就需要对这两种类型的光进行分离,由于光束中的光波长不相同,可利用光波分离将不同的光分开。
许多装有目镜的芯片检测仪采用的是表面照明方式,激发光束与释放光束从样品到目镜经过同样的路径只是方向相反。这种途径使得从样品上反射和散射的光与荧光束混合在一起,所以需要用光束分离器对混合光进行分离。
从理论上来说,光束分离器可以完全将激发和释放光束分开,但实际上并非如此,通常在探测器前放滤光片过滤释放光束。这些滤光片只允许染料的释放高峰附近很窄的一段波长的光通过,而其他波长的光包括激发光都被阻挡了。这是微阵列芯片检测仪必需的第二道光束分离装置。
有的芯片检测仪不用光束分离器而是将激发光束和释放光束放在不同的轴上。该方法能将释放光路径的激发光发射回去,但却难以达到较高的数值孔径,因为目镜离样品很近,所以激发光束能进入目镜的角度范围很小。其他具有区分不同波长光束的装置有棱镜、光栅等,这些装置还可产生一些特殊的作用,如连续的光波调谐功能。然而,在微阵列中,由于要求对激发光有高度的敏感性,因而对释放光装置也相应要求有很高的精密度。
检测荧光扫描仪的探测器:
将微弱的荧光信号转化为电信号,在微阵列芯片检测仪中的光线探测器有:光电倍增管、CCD点阵探测器、雪崩光电二极管等。各种装置有其优点也有其缺点。不同检测范围的芯片检测仪要根据它们各自的特点来选择合适的探测装置。
芯片检测仪扫描检测时通常是在室温下进行,此时玻片上各点样品已经干燥,然而,有些染料如FITC在潮湿的环境下才能释放出强烈的荧光,所以研究者们在待测样品上滴加适量的缓冲液,然后盖上盖玻片进行观察。这就需要载样盒能够容纳载玻片与盖玻片叠加之后的厚度,芯片检测仪在扫描时聚焦于盖玻片下的那一层平面进行扫描。
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