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共聚焦显微镜可以进行细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究,并能提供定量荧光测定、定性图像分析等研究手段,结合其他相关生物技术,在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域有广泛应用。
传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰。而共聚焦显微镜则在荧光显微镜成像基础上利用激光作为光源,采用共轭聚焦装置,并利用计算机对所观察分析对象进行数字图像处理的一套观察和分析系统。
共聚焦显微镜主要组成包括:显微镜、激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统(包括数据采集,处理,转换,应用软件)、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统。
1、激光器:随着激光技术的飞速发展,共聚焦显微镜可以根据研究需要选择不同的激光器、如:R-HeNe(633nm)、ArUV(351、364nm)、HeCd(442nm)、AR(458、477、488、514nm)、ArKr(488、568、647nm)、Kr(568nm)、G-HeNe(543nm)、Diode(405nm)等。
2、照明针孔:照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的。激光经照明针孔形成点光源,相干性好,频率、振动方向、相位高度一致。
3、光束分离器:从样晶上反射和散射的光与荧光束混合在一起,所以需要用光束分离器将激发和释放光束分开。
4、物镜:选大数值孔径平场复消色差物镜为好,有利于荧光的采集以获得更清晰的成像。
5、焦平面:激光点光源照射标本,在焦平面处聚焦,激发荧光标记的样本发射荧光,形成焦点光斑。该光斑经过物镜、光束分离器等一系列装置的处理,分别在照明针孔及探测器针孔两处聚焦,共聚焦的含义由此而来。
6、探测器针孔:起到空间滤波器的作用。Zda限度地阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光,以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置,因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息。
7、探测器:用光灵敏度极高、响应速度极快的电倍增管(PMT)检测激发荧光,转变为电信号传输至计算机,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。
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与传统的光学显微镜相比,共聚焦显微镜有以下优势:
1、点光源:
传统光学显微镜以自然光或内置光等场光源作为光源,光谱范围广,标本上的点会受到临近的色散光和衍射光的干扰,使图像的分辨率和对比度降低,而且像的边缘常常带有光晕。
共聚焦显微镜以激光作为光源,相干性好、方向性强、亮度高;激光前的光栅针孔能过滤激光,使其形成一个精细的光点,对样品进行单层扫面,有效消除了球差和色差。
2、共聚焦技术:
普通光学显微镜收集的光为来自焦平面上下的非测量光以及样品反射光、衍射光的叠加,分辨率较低。
共聚焦显微镜利用共聚焦原理,将焦平面上非测量光点形成的杂散光和样品不同焦平面的反射光、衍射光过滤,只使焦平面的光穿过检测针孔,大大提高了图像质量。
3、三维成像:
光学显微镜为减少非测量光的干扰,对切片厚度要求较高,制样过程较为复杂。并且只能形成平面像。
共聚焦显微镜同时具有横向分辨率(0.2~0.25μm)和纵向分辨率(0.5~0.6μm),通过控制载物台横纵向移动,可实现样品的逐点、逐面、逐层扫描,直接观察标本的不同剖面的细微结构,形成立体图像。
共聚焦显微镜是近代生物医学图像仪器Z重要的发明之一。以激光为光源,在传统的荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置,并利用计算机进行图像处理,将光学成像的分辨率提高了30% ~40%。经过处理后,可以观察到细胞或亚细胞水平的荧光图像,并对样品开展全面、细致的研究。
目前,共聚焦显微镜在细胞生物学中的应用主要有以下方面: ①定量荧光测量; ②定量共聚焦图像分析; ③三维重组分析生物结构; ④动态荧光测定; ⑤荧光光漂白回复测定活细胞的动力学参数等。
共聚焦显微镜主要用于具有荧光样品的测定,因此对于没有自发荧光的生物样品,就需要对样品进行前处理,使其具有荧光标记,再进行检测。能否用共聚焦显微镜顺利地观察到样品的荧光图像以及观察到图像质量的好坏,在很大程度上取决于样品的前处理技术。因此,对样品进行的前处理应该具有荧光标记反应特异性强,荧光定位准确、强度适宜,不破坏样品的结构、形态,对试验结果无干扰等特征。此外,还应根据试验材料、试验目的、需检测的指标等确定合适的样品前处理技术。
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