荧光显微镜的使用方法|注意事项

　　荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。

荧光显微镜的使用方法

　　1、用窗帘遮蔽光线，关闭房间内的电灯，除去荧光显微镜的防尘罩，确保荧光显微镜灯室通风良好、无遮盖。装上汞灯灯箱，并转动灯箱卡圈上的拨杆，将灯箱与镜臂连接。

　　2、将汞灯灯箱的电源插头插入荧光电源箱后的插座，再将荧光电源箱的插头插入220V外接电源。

　　3、打开荧光显微镜电源开关，电压表显示出电源电压，如电源电压波动不大于额定电压值的5%，即可按下启动开关点燃汞灯，如因天气太冷或电压不稳定等原因，一次启动未点燃汞灯，可以多按几次。待超高压汞灯弧光达到稳定状态并达到Zda发光效率，即可开始工作。

　　4、灯泡的调中：

　　①任选一块标本放在荧光显微镜载物台上。

　　②转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移出光路，转动滤色片组转换手轮，将紫光(V)或蓝光(B)或绿光(G)激发滤色片组转入光路，并将25荧光物镜转入光路。

　　③调节粗微调手轮，将标本像调焦清晰。

　　④前后推动垂直照明器右边的聚光镜调焦推杆，使视场光栏成像清晰，转动视场光栏拨杆将视场光栏收小，调节视场光栏调中螺钉使视场光栏居中，然后再将视场光栏开至Zda。

　　⑤转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移入光路，前后调节灯箱上的聚光镜拨杆，使汞灯的弧光在视场内成像清晰。

　　⑥调整灯箱上的灯泡水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使汞灯的弧光居中。

　　⑦调整反光镜水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使光源的反射像与汞灯的弧光分开。

　　⑧转动聚光镜旋钮把聚光镜移出光路，此时视场照明均匀。

　　5、荧光观察：

　　①将荧光染色标本放到荧光显微镜载物台上。

　　②将10x平场物镜或25x荧光物镜转入光路，调节载物台纵横移动手轮，将标本移入光路。

　　③转动滤光片转换拨轮，将荧光染色标本所需要的激发滤光片组转入光路。激发滤光片组编号刻在滤片组转换拨轮上。滤光片选择正确与否，是荧光显微镜能否得到正确应用的关键。选用滤光片时，必须遵守斯托克斯定律：激发滤光片的透射波长<双色束分离器的透射波长<阻断滤光片的透射波长。

　　④调节粗调手轮，当看清荧光图像轮廓后，再用微调手轮调焦，直至看到清晰的荧光图像。

　　⑤当需要得到较强的荧光图像时，可转动聚光镜旋钮把聚光镜移入光路，可获得较明亮的荧光图像。

　　⑥当需要使用40x或100x荧光物镜观察时，应在标本和物镜间加上甘油，油中不能有影响观察的小泡或杂质。使用时可使甘油慢慢浸润一会儿，然后轻轻左右来回转动物镜转换器以排除气泡。

　　6、荧光显微摄影

　　由于荧光图像一般均较明场观察暗得多，所以进行荧光显微摄影需要较长的曝光时间，在曝光时应注意避免荧光显微镜震动。为了缩短曝光时间，可选择倍率较低的摄影目镜或感光度较高的摄影胶片如ASA200以上或DIN24以上。

　　荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。

　　7、荧光图像的记录方法

　　荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上是可靠的。

　　8、荧光显微镜使用结束，关闭所有电源，做好镜头和载物台的清洁工作，待灯室冷却至室温后，用防尘罩盖好显微镜，并做好使用记录。

荧光显微镜使用注意事项

　　1、严格按照荧光显微镜说明书要求进行操作，不要随意改变程序。

　　2、荧光显微镜应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。

　　3、防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。

　　4、检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱;标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱;所以，Z多不得超过2～3h。

　　5、荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。

　　6、标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。

　　7、荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“-”表示无或可见微弱荧光。“+”表示仅能见明确可见的荧光。“++”表示可见有明亮的荧光。“+++”表示可见耀眼的荧光。

荧光显微镜标本制作要求

　　1、载玻片

　　载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。

　　2、盖玻片

　　盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光方可激发标本。

　　3、标本

　　组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。

　　4、封裱剂

　　封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5~9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。

　　5、镜油

　　一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，Z好使用特制的无荧光镜油，也可用甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。