冷冻扫描电镜的原理及优势

　　冷冻扫描电镜基于扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术发展而来，具有能在高真空状态下观察含水样品、分辨率高、制样简单快速、可对样品进行断裂刻蚀等优点，是生命科学研究的有力工具。与同样可以观察含水样品的环境扫描电镜相比，冷冻扫描电镜具有能在高真空状态下观察含水样品、分辨率较高、可对样品进行断裂刻蚀等优点。

冷冻扫描电镜的原理

　　冷冻扫描电镜的关键是超低温冷冻制样及传输技术，常规扫描电镜上可以通过加载低温冷冻制备传输系统和冷冻样品台来改造升级为冷冻扫描电镜。超低温快速冷冻制样技术可使水在低温状态下呈玻璃态，以减少冰晶的产生，从而不影响样品本身结构;冷冻传输系统则保证在低温状态下将样品转移至电镜腔室并进行观察。其制样过程简单快速，无需对样品进行脱水、干燥，也无需使用锇酸等有毒试剂，只需利用超低温快速冷冻完成样品的固态化后，通过冷冻传输系统在低温状态下将样品转移至电镜样品舱中的冷台上即可观察。此外，冷冻扫描电镜样品制备舱的冷冻台上配有冷刀、加热器和喷镀装置，可简单快速地对预冷过的样品进行断裂、升华、镀金，暴露其内部结构以供观察。

　　冷冻扫描电镜的工作流程如下：①将样品用冷冻胶水固定于样品托上;②将样品插入温度低于130K的过冷液氮雪泥中快速冷冻固定，在低于130K时，水分子的移动性非常慢以至于不能形成有害的冰晶;③在真空条件下，将样品转移到安装在扫描电镜样品舱端口上的制样舱中的冷台上，根据需要进行冷冻断裂、冷冻升华刻蚀和溅射镀膜等处理;④在真空条件下，将样品转移至扫描电镜样品舱中的冷台上进行超微结构观察。

冷冻扫描电镜的优点

　　冷冻扫描电镜具有一系列优点：

　　①能直接观察含水和液体样品，保持其中的可溶性物质，对样品的机械损伤小;

　　②制样过程快速，可在5min内完成新鲜材料的冷冻、断裂、喷镀、进入电镜观察;

　　③基本不使用有毒试剂;

　　④与环境扫描电镜相比，样品室为高真空状态，分辨率高于前者;

　　⑤具有选择性刻蚀能力，可通过断裂升华显露样品内在信息;

　　⑥具有重复使用样品能力，可对样品重复断裂涂覆;

　　⑦特别适合用于观察冰淇淋等低温样品的超微结构。

冷冻扫描电镜与常规扫描电镜比较

　　对于常规扫描电镜而言，用于观察的样品必须是经过彻底干燥处理、无水且无其他易挥发性溶剂，含水量高的样品在扫描电镜真空的镜筒中将造成诸多不良后果。冷冻扫描电镜可以不经过干燥直接观察含水样品。冷冻扫描电镜利用低温快速冷冻技术使样品中的水在低温状态下呈玻璃态，既减少了冰晶的产生，又阻止了水等挥发性液体的蒸发，从而在不影响样品本身结构的同时使其可以在高真空的扫描电镜样品舱中进行观察，分辨率可达到1nm。

　　常规扫描电镜一般只能观察组织器官的游离面和细胞的表面形态结构，不能观察其内部结构;若想观察组织和细胞的内部结构，需在制样时采用特殊方法割断组织块，以暴露内部结构。而冷冻扫描电镜样品制备舱的冷冻台上配有冷刀和加热器，可以简单快速地对预冷过的样品进行断裂，再通过升华对样品进行选择性蚀刻，暴露其内部结构以供观察。整个过程快速，无需锇酸处理，且进入电镜腔室观察后，如不理想，可以随时将样品再次转移至制样舱进行重复断裂，直至目标结构暴露。

冷冻扫描电镜的发展趋势

　　冷冻扫描电镜制样快速简单、可以直接观察含水样品，是研究高度含水的生物材料的强有力工具。但由于仪器的价格昂贵，其应用还不广泛。且冷冻扫描电镜的制样和操作过程对技术人员的要求较高，需要其熟悉各类样品，能根据研究目的快速GX地选择合适的操作条件，以捕捉快速变化的样品表面信息。

　　目前尚未见到冷冻扫描电镜相关的制样方法手册和图集，仅能从文献中获得少量信息，从而制约了冷冻扫描电镜技术的推广和相关研究的深入。因此，加强技术人员之间的交流，开展冷冻扫描电镜制样方法的有益探索并汇总成实验手册，对于冷冻扫描电镜技术的发展至关重要。

　　就冷冻扫描电镜本身而言，如果能够进一步简化仪器的操作步骤、内置更多的标准化前处理条件程序供操作人员选择，将有助于操作人员更快地操作，以便观察易变的样品表面和提高成像质量。例如，如果仪器能在改变加速电压的同时保持电子束流强度不变，那么操作人员就可以少控制一个变量，从而提高操作速度。此外，通过将冷冻部件与更高分辨率的扫描电镜配套使用，可望达到更高的分辨率。