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PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶Z适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。下面就让小编带你了解一下PCR引物设计的目的和原则。
引物设计的目的
为了找到一对合适的核苷酸片段,从而能够对模板DNA序列进行有效地扩增。
引物设计的重要原则
使得特异性和扩增效率Zda限度地提高,同时使得非特异性扩增尽可能的减少。
引物设计的基本原则
1.不能修饰引物的3′端,可以修饰引物的5′端
PCR产物的长度取决于引物的5′端,扩增的特异性不太受到引物的5′端的影响,引物的5′端能够被修饰但不对扩增的特异性产生影响。
因为延伸是以3′端为起点的,因此,3′端不可以进行任何修饰。
2.互补序列不应该存在于引物自身和引物之间
不能有3个以上的引物自身连续互补碱基,不能有4个以上的引物之间连续互补碱基,特别需要防止3′端的互补重叠。
3.引物中四种碱基Z好随机分布
避免连续的3个G或者C出现在引物的3′端,防止在G+C富集序列区域引物产生错配,从而使得扩增的特异性降低。
4.Z佳退火温度为55-60摄氏度,Tm差值应低于1摄氏度
通常情况下,PCR的Z适退火温度要低于引物Tm值5摄氏度左右,若一对引物的Tm差值过大,那么会直接造成PCR失败或者扩增效率下降。
5、通常情况下,G+C含量为40%-60%
引物的解链温度会受到引物的碱基组成的影响。若G+C含量过高,那么解链温度高,容易和非特异性序列杂交,使得非特异性扩增条带出现。若G+C含量过低,那么解链温度低,容易使得引物从模板上解离。
6.通常情况下,引物的长度为18-30碱基
解链温度和反应的特异性与引物长度成正相关。若引物过长,则会使得引物二级结构以及引物二聚体产生;若引物过短,则会降低扩增的特异性。
7.对容易形成二级结构的模板序列区域避开
二级结构会使得PCR和引物与模板杂交变得更加困难,所以,对这种序列区域要尽可能避开。可以使用相关软件对mRNA的稳定二级结构进行预测。
8.引物的特异性要足够
若特异的DNA序列需要从基因组等比较复杂的模板中被扩增,那么需要对目的DNA序列的保守性进行考虑,对于所选引物设计区域序列的非特异性要尽量避免。
06-19
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