等电聚焦电泳的原理

在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）利用一种特殊的缓冲液（两性电解质）将一个pH梯度制造而成，电泳时每种蛋白质将在等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷）聚集从而使得一个很窄的区带形成的一种电泳方法，就是等电聚焦电泳（Isoelectric focusing (IEF), also known as electrofocusing）。

基本原理

在IEF的电泳中，从阳极到阴极分布着具有pH梯度的介质，pH值逐渐增大。两性解离及等电点的特征为蛋白质分子所具备。如此，在碱性区域，带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，直至某一pH位点时电荷失去了而使移动停止，这个地方介质的pH正好和聚焦蛋白质分子的等电点（pl）相等。同理，在酸性区域，带正电荷的蛋白质分子蛋白质分子直到它们的等电点上聚焦为止。由此可知，在此方法中，蛋白质组分的特性量度为等电点，在有pH梯度的凝胶介质中加入等电点不同的蛋白质混合物，在电场内经过一定时间后，各组分在在各自等电点相应的pH位置上聚焦，从而使得分离的蛋白质区带形成。

载体介质

如果两性电解质载体足够理想，那么其在pI处的缓冲能力及电导足够，前者使pH梯度的稳定得到保证，后者允许通过一定的电流。为了使整个体系的电导均匀，不同pI的两性电解质的电导系数应该相似。两性电解质的分子量要小，如此，就能够很容易地应用分子筛或透析方法分开其与被分离的高分子物质，并且不应该使其变性和被分离物质发生反应。

梯度组成

pH梯度有人工pH梯度和天然pH梯度二种pH梯度组成方式，因为人工pH梯度重复性差，和不稳定，所以现在已经看不见使用了。天然pH梯度的建立是将等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物在水平板或电泳管正负极间引入，将酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等在正极端引入，将碱液，如氢氧化钠、氨水等负极端引入碱液。

开始电泳前，两性电解质的混合物pH为一均值，就是各段介质中的pH相等，用pH0表示。当开始电泳后，带负电荷Z多的为混合物中pIZdi的分子，pI1为其等电点，向正极移动速度Z快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至和PI1接近或者比PI1还稍低，这一分子不再向前移动而是在此区域内停留。因为两性电解质具有一定的缓冲能力，从而保持其周围一定的区域内介质的pH在它的等电点范围。第二种两性电解质pH稍高，其等电点为pI2，也向正极移动，因为pI2>pI1，所以定位于diyi种两性电解质之后，如此，经过一定时间后，按各自的等电点具有不同等电点的两性电解质依次排列，使得从正极到负极等电点递增，由低到高的线性pH梯度形成。