琼脂糖凝胶电泳常见问题及解决方法

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

常见问题：

问题：条带缺失

原因一：DNA条带分子量过大

解决方法：使用脉冲凝胶电泳。

原因二：分子量接近的DNA条带没有分开

解决方法：选择适当的凝胶浓度进行电泳。

原因三：电泳缓冲液使用不当

解决方法：SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段，大片段分子不能完全分离；TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段。

原因四：电泳时间过长或电压过高，DNA走出凝胶

解决方法：缩短电泳时间，调整电压。

原因五：电极插反，DNA走出凝胶

解决方法：正确连接电极方向。

问题：条带大小不正确

原因一：核酸降解或形成聚合物

解决方法：加热处理或重新制备样品。

原因二：λDNA酶切Marker的cos位点复性

解决方法：电泳前65°C加热5分钟，冰上冷却5分钟以后上样。

原因三：相同分子量的DNA片段由于结构或序列的差异而有不同的迁移率

解决方法：判断DNA分子是否有特殊结构，如缺口、超螺旋、二聚体等；富含AT碱基的DNA迁移率比同分子量富含GC碱基的DNA片段慢。

原因四：梳子变形，点样孔不在同一水平线上

解决方法：使用完好的梳子制胶。

问题：带型异常

原因一：不同样本的上样条件不同

解决方法：选用相同的上样缓冲液，上样量尽可能接近

原因二：上样量过大或过小

解决方法：选择合适大小的上样孔，样品应完全覆盖点样孔底部

原因三：核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份

解决方法：酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质。

原因四：电泳缓冲液未完全浸没凝胶

解决方法：上样和电泳时，确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶。

原因五：电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和DNA变性

解决方法：根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳。

原因六：凝胶中加入EB造成染色不均

解决方法：加入EB时充分混匀或电泳结束后再染色。

原因七：凝胶中有气泡或污染物

解决方法：使用纯水和洁净容器制胶；缓慢灌胶，并赶除气泡。

问题：DNAMarker降解

原因一：核酸酶污染

解决方法：每次吸取时更换灭菌枪头，勿将电泳缓冲液带入管中；用后密闭4°C保存。

原因二：保存不当

解决方法：4°C或-20°C保存，避免多次反复冻融；不可加热。

问题：DNAMarker无法正确分离

原因一：琼脂糖质量差

解决方法：使用质量可靠的琼脂糖制胶。

原因二：电泳缓冲液多次使用后失效

解决方法：更换缓冲液。

问题：条带黯淡

原因一：核酸浓度过低

解决方法：增加上样量。

原因二：核酸降解

解决方法：使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品。

原因三：DNA条带被示踪染料掩盖

解决方法：提高上样量；避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染料。

问题：条带模糊或弥散

原因一：电泳缓冲液多次使用后失效

解决方法：更换缓冲液。

原因二：核酸部分降解

解决方法：使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品。

原因三：核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份

解决方法：酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质

原因四：电压过低，电泳时间过长

解决方法：根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳。

原因五：染色时间过长或拍照前放置过久，DNA条带弥散

解决方法：电泳结束后及时观察、拍照。