常用化学发光剂

在反应中对能量转移有所参与并且Z后通过发射光子的形式将能量释放的化合物，叫做发光剂。按照上述发光特点，发光剂包含化学发光剂、生物发光剂以及荧光素三种。电化学发光剂、直接化学发光剂与酶促反应的发光底物的发光剂发光剂为常用的三种化学发光剂。

电化学发光剂

在电极表面发生电化学反应发出光的物质，称为电化学发光剂。氧化反应通过阳性电极表面电子供体三丙胺（TPA）与化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+同时有一个电子失去而发生。[Ru(bpy)3]2+从二价而被氧化成三价，变成强氧化剂，阳离子自由基TPA+由于TPA失去电子后被氧化而产生，然而它非常不稳定，自由基TPA会因为阳离子自由基TPA将一个质子（H+）自发地失去而形成，变为一个强还原剂，三价的[Ru(bpy)3]3+通过吸收一个高能量的电子使得激发态的[Ru(bpy)3]2+形成。

激发态的三联吡啶钌不稳定，一个波长为620nm的光子很快被发射出，回到了基态的三联吡啶钌。在电极表面能够周而复始地进行这一过程，使得大量的光子产生，增强了光信号。

直接化学发光剂

直接化学发光剂不需要酶来催化，仅要对溶液的pH等条件进行改变就可以发光的物质。例如在有过氧化氢的稀碱溶液中吖啶酯（acridinium, AE）能够发光。

酶促反应的发光底物

通过酶的降解作用而发出光的一类发光底物，叫做酶促反应的发光底物。目前，碱性磷酸酶（AP）与辣根过氧化物酶（HRP）为化学发光酶免疫技术中常用的酶。4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP，荧光底物）和3-（2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）为AP的发光底物。对-羟基苯 乙 酸和鲁米诺为HRP的发光底物。

1. 4-MUP

4-甲基伞形酮由ALP催化4-MUP而生成，在360nm的激发光的作用下，有448nm的荧光发出，测量可以使用荧光光度计。

2. AMPPD

在碱性条件下，AMP-D阴离子由ALP酶解AMPPD而产生，其状态很稳定，其有2-30min的分解半衰期，有波长为470nm的持续性光发出，在15min时其强度Zgao，在15-60min内，有相对稳定的光强度。

3. 对-羟基苯 乙 酸（HPA)

若存在H2O2，对-羟基苯 乙 酸（HPA)会氧化二聚体（荧光物质）或者被HRP氧化，在350nm激发光作用下，会有450nm波长的荧光发出，测量可以使用荧光光度计。

4. 鲁米诺或其衍生物

一般在碱性缓冲液中进行鲁米诺的氧化反应，将pH8.6Tris缓冲液作为底物液。值得一提的是，即使没有HRP催化，鲁米诺和H2O2也可以缓慢自发发光，但是会在Z后光强度测定中导致空白干扰，所以应当分别成2瓶试剂溶液，当需要使用的时候，再立刻进行混合。然后HRP催化鲁米诺氧化的反应和延长发光时间会由于HRP发光增强剂如某些酚试剂（如邻－碘酚）或萤火虫荧光素酶而增强，使得发光敏感度得到提高。