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切口平移法的操作、影响因素及注意事项

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分子杂交(molecular hybridization)是指使单链核酸碱基序列确定的技术。待测单链核酸与已知序列的单链核酸(叫做探针)间通过碱基配对使可检出的双螺旋片段形成为分子杂交的基本原理。下面就让小编带你了解一下双链DNA探针标记法中的切口平移法。


概念

当有切口在双链DNA分子的一条链上产生时,在切口的3'羟基末端能够通过E.coli DNA聚合酶Ⅰ连接核苷酸。与此同时,从5'→3'的核酸外切酶活性为该酶所具有,可以从切口的5'端将核苷酸去除。因为一边将核苷酸切去,一边又在切口的3'端将核苷酸补上,使得切口沿着DNA链移动,之前没有放射性的核苷酸可以使用放射性核苷酸代替,在合成新链中掺入放射性同位素。50-500个核苷酸通常为Z适合的切口平移片段。


01.jpg


操作准备

设备:恒温水浴锅、高速台式离心机等。

材料:10pmol/μl 待标记的寡核苷酸

试剂:10mol/L NH4Ac;1mg/ml DNA酶Ⅰ;pH8.0,200mmol/L EDTA;4单位/μl E.coli DNA聚合酶Ⅰ;10μCi/μl [α-32 P]dATP或者400 Ci/mmol [α-32 P] dCTP;未标记的dNTP原液;10×切口平移缓冲液


具体操作

将1μlDAN酶 I ,4单位E.coli DNA聚合酶,7μl[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) ,1μg待标记的DNA,5μl10×切口平移缓冲液以及10μl的未标记的dNTP加水混合成50μl的溶液。将其放入15℃水中水浴60min,将5μl EDTA加入使反应终止。将醋酸铵加入到反应液中,使得溶液的Z终浓度为0.5mol/L, 将两倍体积预冷无水乙醇加入使DNA探针沉淀从而回收。


影响因素

以下几种因素可能对切口平移反应产生影响:

1.DNA模板中的YZ物

酶的活性会受到DNA模板中的YZ物的影响,所以实验时应当使用经过认真纯化之后的DNA。


2.E.coli DNA聚合酶的质量和DNA酶Ⅰ的用量

产物片段的大小会受到E.coli DNA聚合酶的质量和DNA酶Ⅰ的用量的影响。


3.模板中核苷酸被置换的程度和[α-32 P]dNTP的比活性

模板中核苷酸被置换的程度和[α-32 P]dNTP的比活性对产物的比活性起到决定作用。


注意事项

1.所得到的探针比活性取决于DNA酶Ⅰ的活性,如果DNA酶Ⅰ具有较高的活性,那么所得探针就具有较高的比活性,然而其却具有较短的长度。


2.探针标记一般使用[α-32 P]-dNTP,虽然3H,32P及35S标记的dNTP也都能够使用。


2005-07-17 浏览次数:2984次
本文来源:https://www.yiqi.com/daogou/detail_3726.html
热门标签: 随机引物合成法的操作、注意事项和优点DNA分子杂交原理和意义
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