对氨基酸进行重复添加的过程,称为多肽合成。通常由C端(羧基端)向N端(氨基端)合成,为固相合成顺序。从前,在溶液中进行多肽合成,叫做液相合成法。
自从1963年,固相多肽合成方法被Merrifield创立成功以来,通过不断的完善与改进,目前为止,在多肽与蛋白质合成中,固相法已经成为了一个常用的技术,其克服了经典液相合成法的缺点,使得每步产品提纯的难度大大地得到减轻。
固相多肽合成的步骤:
1.树脂的选择及氨基酸的固定
聚乙烯一乙二醇脂、聚酰胺以及交联聚苯乙烯这三类树脂主要用来作为多肽合成的高分子的载体。通过保护的氨基酸的羧基同树脂的反应基团之间形成共价键来来使氨基酸的固定得以实现。
2.氨基、羧基、侧链的保护及脱除
需要保护暂不参与形成酰胺键的氨基和羧基,以便使具有特定的氨基酸顺序的多肽成功合成,同时也需要保护氨基酸侧链上的活性基团,当完成反应后,再去除保护基团。
这些年以来,FMOC合成法的应用相当的广泛。一般使用形成酯基的方法来保护羧基。逐步合成中保护羧基的常用方法为甲酯和乙酯。
3.成肽反应
固相中的成肽反应通常是在溶液内放入一个氨基被保护的氨基酸以及一个羧基被保护的氨基酸,需要将酰胺键生成,不形成肽键,活化活化变成混合酸酐、活泼酯、酰氯或用强的缩合剂(如碳二亚氨)形成对称酸酐等方法来使酰胺键形成为常用的手段。
4.裂解及合成肽链的纯化
裂解和脱侧链保护基,FMOC法直接用TFA,而BOC法用TFA+H。有些时候,由于不同的条件,也会采用其它碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法。一般采用GX液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等进一步的精制、分离与纯化合成肽链。
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