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蛋白纯化中Z常用的一种方就是色谱法(chromatography),这种方法除了能够将大量的纯化蛋白质制备出来,还能够使蛋白质的生物学活性得以保持。有多种多样的色谱,包括GX液相色谱以及常规色谱,离子交换GX液相色谱(ion exchange HPLC)以及反相GX液相色谱(reversed-phase HPLC,RP-HPLC)均属于GX液相色谱,而常规色谱分别为亲和色谱、离子交换色谱以及凝胶过滤色谱。纯化蛋白质可以按照目标蛋白性质的不同对色谱分离技术进行相应的选用。
1.亲和色谱法
与其结构相对应的专一分子发生可逆性结合的特征为许多生物大分子所具备,例如生物素与亲合素、核酸片段与其互补的核酸序列、激素与受体、抗原与抗体、辅助因子、酶与YZ剂以及酶与底物等。这种分子之间的结合称为亲和力。
利用生物大分子间所具有的特异性亲和能力进行分离的方法叫做亲和色谱(affinity chromatography)。这种方法一般在不溶于水的化合物上固定可亲和的一对分子中的一方,作为色谱的支持体即载体,使之固相化,作为固定相;另一方随流动相流经固定相,双方就能够发生特异性结合。经过一段时间的洗涤流动相,就能够去除杂质,之后再对亲和吸附的可逆特性进行利用,改用特殊的流动相解离下所需分离的物质,从而使得纯化的物质获得。
亲和色谱法中有很多种类的载体,琼脂糖凝胶(sepharose)Z为常用,有较多的羟基在其分子上,活化后能够耦联亲和分子相,除此以外,其有着稳定的理化性质,不会对色谱的分离过程产生影响。能够在温和条件下操作亲和色谱法,纯化过程分辨率高,快速,简单,对于性质不稳定并且分离含量极少的生物活性物质非常的有效。然而由于特异的亲和力不是任何生物大分子之间均具有,所以需要制备专一的亲和色谱柱针对于某一种亲和分子。所以亲和色谱的应用具有一定的局限性,主要在酶、抗原、抗体的分离与纯化时使用。
2.凝胶过滤色谱法
凝胶过滤色谱法(gel-filtration chromatography, GFC)又叫做排阻色谱。凝胶是一类具有三维空间结构的多孔网状颗粒物质,例如葡聚糖凝胶(sephadex)和琼脂糖凝胶(sepharose)。在色谱柱中装入凝胶颗粒就能够用来分离物质。当从凝胶柱通过被分离物质时,凝胶内部,大于凝胶孔径的分子进入不了,只能够流动和分配于凝胶颗粒之间的空隙中,只流经很短的路途,能够白很快的洗脱出来。而小于凝胶孔径的分子则进入凝胶颗粒内部,穿行在凝胶内部,有着很慢的移动的速度,流经的路程长,Z后洗脱出来。纯化的物质的获得是通过对不同时相的洗脱液的分别收集。
3.离子交换色谱法
按照物质的分子大小、极性、酸碱度的不同进行分离的技术,叫做离子交换色谱法(ion exchange chromatography,IEC),一般吸附、吸收、扩散、穿透、静电引力等复杂的物理化学过程包含其中。
自然界中生物大分子均带有电荷,也包括蛋白质。当从离子交换色谱柱通过所需分离的物质时,因为分子量、所带电荷等不同,固定相利用静电引力吸附了一些物质,缓冲液首先洗脱出了未被吸附的物质。被吸附的物质因为所带电荷多少不同,有着大小不同的亲和力,梯度离子缓冲液会先后洗脱出它们。分离出同一溶液中的不同物质。色谱柱中,使用填充的阳离子交换剂来分离带负电荷物质,使用填充的阴离子交换剂分离带正电荷物质。
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