免疫印迹法操作步骤

免疫印迹法就是将蛋白质往膜上转移，之后利用抗体进行检测。能够使用相应抗体作为一抗对已知表达蛋白进行检测，能够通过融合部分的抗体对新基因的表达产物进行检测。

操作步骤

一、获取蛋白质样品：

细菌诱导表达后，能够通过电泳上样缓冲液将细胞直接裂解，将匀浆缓冲液加在真核细胞上，机械或超声波室温匀浆0.5-1分钟。之后4摄氏度下13,000g离心15分钟，取上清液作为样品。

二、电泳：

对电泳凝胶进行制备，进行SDS-PAGE。

三转移：（半干式转移）

1、完成电泳后将胶条切成合适大小，使用转膜缓冲液平衡，分别进行3次，每次5分钟。

2、膜处理：将与胶条同样大小的滤纸和NC膜预先裁好，将其在转膜缓冲液中浸没10分钟。

3、转膜：转膜装置按照从下至上的顺序依次将阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板放好，精确对齐滤纸、凝胶、NC膜，每一步均将气泡去除，将500g重物压上，吸干碳板上多余的液体。将电源接通，恒流1mA/cm2，转移1.5hr。完成转移后，将电源断开，取出膜，对待测膜条割取来做免疫印迹。在膜染色液中放入有蛋白标准的条带染色50秒之后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干，保存在两层滤纸之间，和显色结果对比。

四免疫反应：

1、洗膜使用0.01M PBS进行清洗，每次5分钟，一共3次。

2.将包被液加入加入，室温下保持2小时。

3.将包被液弃掉，洗膜使用0.01M PBS进行清洗，每次5分钟，一共3次。

4.将一抗加入（用0.01M PBS根据合适稀释比例进行稀释，膜必须全部为液体所覆盖），在4摄氏度下放置超过12小时，阴性对照，一抗使用1%BSA替代，其余步骤和实验组一样。

5.将1%BSA和一抗弃掉。膜使用0.01M PBS分别进行清洗，每次5分钟，一共4次。

6、将辣根过氧化物酶偶联的二抗加入（用0.01M PBS根据合适稀释比例进行稀释），平稳摇动，室温下保持两个小时。

7、将二抗弃掉，膜使用0.01M PBS进行清洗，每次5分钟，一共4次。

8、将显色液加入，避光显色直到有条带出现放入双蒸水中使得反应终止。