影响毛细管电泳仪的分离因素

一、毛细管电泳仪的兴起与发展

毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)，又称gao效毛细管电泳(HPCE)是近年来发展Z快的分析化学研究领域之一。1981年Jorgenson等在75μm内径的毛细管内用高电压进行分离，创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等发展了毛细管胶束电动色谱(MECC)。1987年比Hjerten建立了毛细管等电聚焦(CIEF)，Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳(CGF)。1988—1989年出现了diyi批毛细管电泳仪CE商品仪器，1989年diyi届国际毛细管电泳会议召开，标志了一门新的分支学科的产生。

短短的几年内，由于毛细管电泳仪CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对生物大分子(肽、蛋白、DNA等)的高度分离分析的要求，得到了迅速发展，正逐步成为生命科学及其它学科实验室中一种常用的分析手段。近三年来国际毛细管电泳会议与会者均达700—800人，1996、1997两年公开发表的有关毛细管电泳仪CE论文达3600余篇。欧洲、美国国内及日本也相继召开毛细管电泳仪CE地区性国际会议。

我国在毛细管电泳仪CE领域研究起步早、发展快、研究工作较全面、有的研究成果达到国际先进水平。定期召开全国CE会议及亚太地区国际会议，在国际上已有一定的影响。1984年zhong国科学院化学所竺安教授在国内率先开展毛细管电泳仪CE研究，迄今国内已有几百个单位开展毛细管电泳仪CE研究和应用。

从毛细管电泳仪CE理论到各种模式及各方面应用，国内均在进行。1998年举行的第三届全国CE会议共收录论文129篇，同时举行的第二届亚太国际会议也取得了成功。毛细管电色谱(CEC)、CE/MS联用、低背景毛细管梯度凝胶电泳、手性药物分离、逆流聚焦及脱氧核糖核酸(DNA)各种毛细管电泳仪CE测定方法等一批研究成果均达到国际先进水平。

二、毛细管电泳仪的基本原理

毛细管电泳仪CE是以高压电场为驱动力。以毛细管为分离通道，依据样品中各组成之间淌度和分配行为上的差异，而实现分离的一类液相分离技术。仪器装置包括高压电源、毛细管、柱上检测器和供毛细管两端插入又和电源相连的两个缓冲液贮瓶，在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象称电泳。

CE所用的石英毛细管在PH>3时，其内液面带负电，和溶液接触形成一双电层。在高电压作用下，双电层中的水合阳离子层引起溶液在毛细管内整体向负极流动，形成电渗液。

带电粒子在毛细管内电解质溶液中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)二者的矢量和。带正电荷粒子Zxian流出，中性粒子的电泳速度为“零”，故其迁移速度相当于EOF速度，带负电荷粒子运动方向与EOF方向相反，因EOF速度一般大于电泳速度，故它将在中性粒子之后流出，各种粒子因迁移速度不同而实现分离，这就是毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis，CZE)的分离原理。

三、影响毛细管电泳仪的分离因素

1.缓冲液

毛细管电泳仪缓冲试剂的选择主要由所需的pH决定，在相同的pH下，不同缓冲试剂的分离效果不尽相同，有的可能相差甚远。毛细管电泳仪CE中常用的缓冲试剂有：磷酸盐、硼砂或硼酸、醋酸盐等。

缓冲盐的浓度直接影响到电泳介质的离子强度，从而影响Zeta电势，而Zeta电势的变化又会影响到电渗流。缓冲液浓度升高，离子强度增加，双电层厚度减小，Zeta电势降低，电渗流减小，样品在毛细管中停留时间变长，有利于迁移时间短的组分的分离，分析效率提高。

同时，随着电解液浓度的提高，毛细管电泳仪电解液的电导将大大高于样品溶液的电导而使样品在毛细管柱上产生堆积的效果，增强样品的富集现象，增加样品的容量，从而提高分析灵敏度。但是，毛细管电泳仪电解液浓度太高，电流增大，由于热效应而使样品组分蜂形扩展，分离效果反而变差。此外，离子还可以通过与管壁作用以及影响溶液的粘度、介电常数等来影响电渗，离子强度过高或过低都对提高分离效率不利。

2.pH值

毛细管电泳仪缓冲体系pH的选择依样品的性质和分离效率而定，是决定分离成败的一大关键。不同样品需要不同的pH分离条件，控制缓冲体系的pH值，一般只能改变电渗流的大小。pH能影响样品的解离能力，样品在极性强的介质中离解度增大，电泳速度也随之增大，从而影响分离选择性和分离灵敏度。

pH还会影响毛细管内壁硅醇基的质子化程度和溶质的化学稳定性，pH在4-10之间，硅醇基的解离度随pH的升高而升高，电渗流也随之升高。因此，pH为分离条件优化时不可忽视的因素。

3.分离电压

在毛细管电泳仪CE中，分离电压也是控制电渗的一个重要参数。高电压是实现毛细管电泳仪CE快速、gao效的前提，电压升高，样品的迁移加大，分析时间缩短，但毛细管中焦耳热增大，基线稳定性降低，灵敏度降低；分离电压越低，分离效果越好，分析时间延长，峰形变宽，导致分离效率降低。

因此，相对较高的分离电压会提高分离度和缩短分析时间，但电压过高又会使谱带变宽而降低分离效率。电解质浓度相同时，非水介质中的电流值和焦耳热均比水相介质中小得多，因而在非水介质中允许使用更高的分离电压。

4.温度

温度影响分离重现性和分离效率，控制温度可以调控电渗流的大小。温度升高，缓冲液粘度降低，管壁硅轻基解离能力增强，电渗速度变大，分析时间减短，分析效率提高。但温度过高，会引起毛细管柱内径向温差增大，焦耳热效应增强，柱效降低，分离效率也会降低。

5.添加剂

在电解质溶液中加入添加剂，例如中性盐、两性离子、表面活性剂以及有机溶剂等，会引起电渗流的显著变化。表面活性剂常用作电渗流的改性剂，通过改变浓度来控制电渗流的大小和方向，但当表面活性剂的浓度高于临界胶束浓度时，将形成胶束。

加入有机溶剂会降低离子强度，Zeta电势增大，溶液粘度降低，改变管壁内表面电荷分布，使电渗流降低。在电泳分析中，缓冲液一般用水配制，但用水一有机混合溶剂常常能有效改善分离度或分离选择性。

6.进样

毛细管电泳仪CE的常规进样方式有两种：流体力学和电迁移进样。电迁移进样是在电场作用下，依靠样品离子的电迁移和(或)电渗流将样品注入，故会产生电歧视现象，会降低分析的准确性和可靠性，但此法尤其适用于粘度大的缓冲液和CGE情况。

流体力学进样是普适方法，可以通过虹吸、在进样端加压或检测器端抽空等方法来实现，但选择性差，样品及其背景同时被引入毛细管，对后续分离可能产生影响。通过进样时间也可以来改善分离效果，进样时间过短，峰面积太小，分析误差大。进样时间过大，样品超载，进样区带扩散，会引起峰之间的重叠，与提高分离电压一样，分离效果变差。

另外，毛细管电泳仪的高分离性能以及消耗试剂少等特点使其分析领域得到了广泛的应用，但是其常规分析的灵敏度不能适应痕量分析的要求，限制了毛细管电泳仪的应用和推广。样品前处理技术可以提高样品通量或将痕量分析物进行预富集，去除样品基质，将其与毛细管电泳技术联用不仅可以提高分析的灵敏度，同时也消除了大部分可能的基质干扰，是一种比较理想的富集分离检测技术。