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中国仪器网 中国仪器网 高效液相色谱仪

高效液相色谱仪的原理|结构|应用

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高效液相色谱仪是色谱法中一个重要的仪器,以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。高效液相色谱仪应用很广泛,基本能对有机化合物中百分之七十到百分之八十的化合物进行分离与检测。目前,高效液相色谱仪已成为大多数化学行业和生命科学行业中的标准配置,如药物研制和生产、蛋白质、食品安全、环境、国土安全和石油化工等市场。

高效液相色谱仪

高效液相色谱仪的前景

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  高效液相色谱仪也叫高压液相色谱、高速液相色谱或高分离度液相色谱。是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。

高效液相色谱仪的发展历史

  1960年代,由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性,为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质,气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪,开启了高效液相色谱仪的时代。高效液相色谱仪使用粒径更细的固定相填充色谱柱,提高色谱柱的塔板数,以高压驱动流动相,使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。

高效液相色谱仪的前景.jpg

  在此后的时间里,高效液相色谱仪成为最为常用的分离和检测手段,在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。

高效液相色谱仪的前景分析

  1、高效液相色谱仪在石油化工方面的前景

  ①在石油工业化工产品分析中对高效液相色谱仪的应用:

  高效液相色谱分析技术在添加剂的分离和组成、石油化工产品、重质油以及复杂原料油等方面都可以将样品本身具备的性质和结构保存下来,可以使样品实现无损失可回收,而且还可以保证快速分离分析的实现,因此其在分析石油化工生产和产品时发挥着十分重要的作用。相对于ASTM分析法而言,高效液相色谱分析技术具有容易自动控制、重复性好以及速度快的特点,然而其在对轻质石油产品以及重质石油产品进行分离的时候,首先要除去沥青,而且不能够忽视在饱和烃洗提过程中沥青质的沉淀和吸附对结果造成的影响。

  ②在石油产品鉴定技术中对高效液相色谱仪的应用:

  液相色谱法在石油产品鉴定技术中属于一种标准的分离分析方法,特别是在分析蒸气压低的样品组分以及热稳定性差组分

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高效液相色谱仪原理

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  高效液相色谱仪是在经典液相色谱仪的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱仪的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱仪。高效液相色谱仪按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

液固色谱法

  使用固体吸附剂,被分离组分在色谱柱上根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝,粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分,大多数用于非离子型化合物,离子型化合物易产生拖尾。常用于高效液相色谱仪分离同分异构体。

高效液相色谱仪原理.jpg

液液色谱法

  使用将特定的液态物质涂于担体表面,或化学键合于担体表面而形成的固定相,分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。

  涂布式固定相应具有良好的惰性;流动相必须预先用固定相饱和,以减少固定相从担体表面流失;温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化;另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失,现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相,如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

  液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。

  正相色谱法:采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相);流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷),常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯 甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)。

  反相色谱法:一般用非极性固定相(如C18、C8);流动相为水或缓冲液,常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水

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高效液相色谱仪结构

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  高效液相色谱仪一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等。

一、输液泵

  1、泵的构造和性能

  输液泵是高效液相色谱仪中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能:①流量稳定,其RSD应<0.5%,这对定性定量的准确性至关重要;②流量范围宽,分析型应在0.1~10ml/min范围内连续可调,制备型应能达到100ml/min;③输出压力高,一般应能达到150~300kg/cm2;④液缸容积小;⑤密封性能好,耐腐蚀。

  高效液相色谱仪泵的种类很多,按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。恒压泵受柱阻影响,流量不稳定;螺旋泵缸体太大,这两种泵已被淘汰。目前应用最多的是柱塞往复泵。

  柱塞往复泵的液缸容积小,可至0.1ml,因此易于清洗和更换流动相,特别适合于再循环和梯度洗脱;改变电机转速能方便地调节流量,流量不受柱阻影响;泵压可达400kg/cm2。其主要缺点是输出的脉冲性较大,现多采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式,一般说来并联泵的流量重现性较好(RSD为0.1%左右,串联泵为0.2~0.3%),但出故障的机会较多(因多一单向阀),价格也较贵。

高效液相色谱仪结构.jpg

  2、泵的使用和维护注意事项

  为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性,必须按照下列注意事项进行操作:

  ①防止任何固体微粒进入泵体,因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀,因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏,而常用的方法是滤过,可采用Millipore滤膜(0.2µm或0.45µm)等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒(或片)。输液泵的滤器应经常清洗或更换。

  ②流动相不应含有任何腐蚀性物质,含有缓冲液的流动相不应保留在泵内,尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内,由于蒸发或泄漏,甚至只是由于溶液的静置,就可能析出盐的微细晶体,这些

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高效液相色谱仪使用方法

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  高效液相色谱仪只要求样品能制成溶液,不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。

高效液相色谱仪使用步骤

  1、过滤流动相,根据需要选择不同的滤膜.

  2、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

  3、打开高效液相色谱仪工作站(包括计算机软件和色谱仪),连接好流动相管道,连接检测系统。

  4、进入高效液相色谱仪控制界面主菜单,点击manual,进入手动菜单。

  5、有一段时间没用,或者换了新的流动相,需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵,直接在泵的出水口,用针头抽取。冲洗进样阀,需要在manual菜单下,先点击purge,再点击start,冲洗时速度不要超过10ml/min。

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  6、调节流量,初次使用新的流动相,可以先试一下压力,流速越大,压力越大,一般不要超过2000。点击injure,选用合适的流速,点击on,走基线,观察基线的情况。

  7、设计走样方法。点击file,选取se-lect users and methods,可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法,点击new method。选取需要的配件,包括进样阀,泵,检测器等,根据需要而不同。选完后,点击protocol。一个完整的走样方法需要包括:①进样前的稳流,一般2-5分钟;②基线归零;③进样阀的loading-inject转换;④走样时间,随不同的样品而不同。

  8、进样和进样后操作。选定走样方法,点击start。进样,所有的样品均需过滤。方法走完后,点击postrun,可记录数据和做标记等。全部样品走完后,再用上面的方法走一段基线,洗掉剩余物。

  9、关机时,先关计算机,再关高效液相色谱仪。

  10、填写登记本,由负责人签字。

高效液相色谱仪使用价值

  1、分离分析药物的组分含量:由于一种药剂常含有多组

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高效液相色谱仪注意事项

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  高效液相色谱仪一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。高效液相色谱仪以它分辨率高、分析速度快和应用广泛的优点倍受仪器分析工作者的青睐,广泛地应用于医药卫生、环境监测、食品检测等领域。

高效液相色谱仪使用注意事项

  1、流动相必须用HPLC级的试剂,使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。

  2、流动相过滤后要用超声波脱气,脱气后应该恢复到室温后使用。

  3、不能用纯乙腈作为流动相,这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

  4、使用缓冲溶液时,做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时,然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上,以充分洗去离子。对于柱塞杆外部,做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。

  5、长时间不用高效液相色谱仪,应该将柱子取下用堵头封好保存,注意不能用纯水保存柱子,而应该用有机相(如甲醇等),因为纯水易长霉。

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  6、每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

  7、C18柱绝对不能进蛋白样品,血样、生物样品。

  8、堵塞导致压力太大,按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法;①以异丙醇作溶剂冲洗:②放在异丙醇中间用超声波清洗;③用10%稀硝酸清洗。

  9、气泡会致使压力不稳,重现性差,所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

  10、如果进液管内不进液体时,要使用注射器吸液,通常在输液前要进行流动相的清洗。

  11、要注意柱子的pH值范围,不得注射强酸强碱的样品,特别是碱性样品。

  12、更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗,然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

高效液相色谱仪使用中常见问题

  1、色谱柱中的流动相是否会会排干的问题:

  不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形:不慎未及时补充流动相,泵将溶剂瓶中的流动相吸干了

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高效液相色谱仪常见问题

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  高效液相色谱仪是分析实验室常用的测试仪器之一,其应用越来越广泛。高效液相色谱仪在使用过程中,难免会出现各种各样的问题,并将直接影响到所测数据的准确性和仪器的正常工作。

一、使用试管的问题

  1、试管的洁净问题:

  高效液相色谱仪分析法是一个很灵敏的分析方法,如果因使用不洁净的试管,便会影响试验结果的准确性。例如,在用甲醇作溶剂来溶解样品时,所用的小试管是用橡胶塞来做盖子的,因此,在每次进样时,都有一个保留时间固定的干扰峰存在,后经证实,此干扰峰是由甲醇浸泡橡胶塞而溶下的组分所产生,换用玻璃试管后,干扰峰消除。

  2、塑料试管的溶解问题:

  近年来,一次性塑料试管给试验人员带来了极大的方便,但是,在使用过程中一定要注意有机溶剂对试管的溶解现象,在利用此种试管提取样品时,有些有机溶剂(如氯仿等)对管壁有溶解现象,这些被溶解下来的物质有时也能在检测器上产生信号,从而干扰样品的测定。这时,可用相同的实验条件先行试验一下,看看不含被抽提物时,提取液在检测器上能否产生干扰信号,如确有干扰信号存在,就只能换用耐有机溶剂的玻璃试管了。

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  3、被测样品在试管壁上的吸附问题:

  这个问题也应引起注意,否则也会影响测试结果的准确性,在治疗药物监测中,有些被测药物如阿米替林,丙咪嗪等易吸附在玻璃试管的管壁上,因此,操作中宜采用聚丙烯管,为防止提取中吸附现象的发生,可采用0.5%的已二胺已烷液做为提取剂,可有效地防止吸附。

二、操作进样阀的问题

  目前,在分析型高效液相色谱仪中常用的进样阀是7725型进样阀,其内部的六通阀结构使进样操作非常方便,但是,如果使用不当,也会带来问题。例如,在高效液相色谱法的试验过程中,有时会有异常色谱峰的出现以及重现性不好的问题,这主要是由于操作方法不当所引起,要想解决此类问题,需从以下几个方面入手。

  1、进样量的控制:

  高效液相色谱仪用进样阀来进样时,阀内的样品环

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高效液相色谱仪的应用

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  高效液相色谱仪应用很广泛,基本能对有机化合物中百分之七十到百分之八十的化合物进行分离与检测。目前,高效液相色谱仪已成为大多数化学行业和生命科学行业中的标准配置,如药物研制和生产、蛋白质、食品安全、环境、国土安全和石油化工等市场。

高效液相色谱仪在食品分析上的应用

  食品是人类生存的必需品和能量来源,食品安全关系到人类的身体健康和生命安全,关系到经济健康和社会稳定,在食品生产过程中,各种食品添加剂含量过高会影响人体健康,外界环境污染也会是食品沾污,因此食品分析很重要。高效液相色谱分析法比化学分析法操作简便,快速,融合了液相和气相两种分析方法的优势,因而功效更加明显,正在广泛的在食品检测工作中应用开来。

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  1、食品添加剂分析

  食品添加剂是在食品生产加工过程中,为改善食品色、香、味等品质,以及为防腐和加工工艺的需要,而加入食品中的少量的化学合成或者天然物质。食品添加剂可以分为天然食品添加剂与化学合成食品添加剂。化学合成食品添加剂如果添加不当或者在食品中发生转化则会对人体造成一定的危害。用高效液相色谱仪分析食品添加剂是相当成熟的方法,如梯度洗脱分析食品中的合成着色剂,等度洗脱分析食品中的防腐剂、抗氧化剂等。

  2、食品营养成分分析

  食物中有多种人体需要的营养成分,主要有糖、脂肪、蛋白质高、维生素、无机盐和水六大类。根据在机体内的作用,这些营养成分可以分为构成物质、能源物质和调节物质。蛋白质、无机盐和水是构成物质,糖和脂肪是能源物质,维生素是调节物质。

  3、食品污染物分析

  1983年,联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂法规委员会第十六次会议规定:凡不是有意加入食品中,而是在生产、制造、处理、加工、填充、包装、运输和贮藏等过程中带入食品的任何物质都称为污染物,但不包括昆虫碎体、动物毛发和其他不寻常的物质;残留农药也算是污染物。污染物可能有:化肥、农药、抗菌素、激素、药物和

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