相差显微镜的原理|结构|使用方法

　　相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察。相差显微镜是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。

　　显微镜检查时，视场中的样品只有在其透射光的波长(颜色)和振幅(亮度)与周围介质有明显变化时，才能被眼睛所分辨。照明光线通过无色透明的物体时，透射光的波长和振幅都不发生明显改变，尤其是振幅，几乎无变化。用普通光学显微镜观察时，难以辨清这样物体的结构，必须借助于相差显微镜，使用固定和染色等理化方法，使样品和背景的透射光在波长或振幅上发生变化，即在颜色和亮度上有所差异，以供识别。

　　一束光线在透过折射率不同的透明介质后，产生的衍射光和透过的直射光的波长没有明显变化，只是衍射光的振幅稍小于直射光，这也是透明不均质物质产生些许明暗变化的原因，但这一点变化很小，并不能有效分辨。变化明显的是衍射光相对透射光在相位上有1/4λ的滞后，虽然人眼不能分辨相位的差别，但可以分辨振幅和波长的变化。相差显微镜就是利用这一点，将相位的差别转变成振幅的变化，也就是将本来均为透明但折射率不同的各个结构显现出明暗差距，从而可以被清楚地分辨。

　　可见光光线通过介质水或其他小分子匀质物质时，由于介质分子远小于可见光波长，所以光的衍射现象并不明显，可以说透射光是直射光。但当可将光透过细胞结构或其他粒径与入射光波长相近的物质结构时，就会产生明显的衍射现象，透射光转化为衍射光。也就是说，细胞等常见观察物的结构大小刚好可以使可将光产生衍射现象。相差显微镜就是利用这一点。光波通过小颗粒的物体后产生直射光和衍射光，衍射光的光波振幅小，相位滞后。在光学系统中，这种直射光和衍射光相遇或光的叠加，振幅发生变化，光线或明或暗，就是光的干涉现象。

　　相差显微镜把透过标本的可见光的光程差变成振幅差

　　相差显微镜是利用细胞内结构的细微差别所形成的折射率不同，以及细微结构自身厚度的不同，对光波的影响，通过相差显微镜的放大，达到能被人眼观察的程度。相差显微镜不同于普通光学显微镜，在装置上有四种必不可缺的部件：相差物镜(内有相板)、具有环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色的滤色镜。

　　相差显微镜的相差物镜与普通物镜的主要区别在于具有相板结构，相板是由光学玻璃制成的，利用光的衍射和干涉现象，将直射光和衍射光的相位差转变为振幅差。相差显微镜的相板平面上，有一圈与周围(里外)相板厚度不同的或凸凹的圆环。相板分两部分：

　　①共轭面：通常为环状，是通过直射光的部分。其环是凸起的，也可能是凹陷的。

　　②补偿面：共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分。

　　相差显微镜相板的共轭面或补偿面上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质，通常为氟化镁。当光线通过时，使光波的相位或振幅改变，从而达到不同的目的与观察效果。相板的种类比较多，对光的吸收率高低不同，所以产生不同的反差效果，从反差上大致可分下列两类：

　　①明反差或负反差：

　　是指在相差显微镜的视场中，物像亮度大于背景亮度的现象。在被检物体的折射率大于周围介质时，直射光被相板的共轭面(因为在共轭面上涂有改变相位和吸收光线的物质)推迟1/4波长，同时吸收80%~90%，振幅变小，致使仅由直射光照射的背景变暗。通过补偿面的衍射没有变化，由于直射光推迟1/4波长，两者(直射光与衍射光)有完全相同的相位，合成波P等于直射光S与衍射光D之合，即P=S+D，故振幅加大。所以被检物体比只有直射光照射的背景亮得多。

　　②暗反差或正反差：

　　是指在相差显微镜的视场中，背景亮度大于物像亮度的现象。与明反差相反，把通过补偿面(因为在相板的补偿面上涂有改变光波相位的物质)的衍射光推迟1/4波长，使衍射光与直射光的相位相差1/2波长，同时，直射光在

　　相差显微镜是利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅(光强度)的差别，经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测的显微镜。

　　1、相差物镜的调换安装

　　从相差显微镜物镜转换器上拆下普通物镜，旋入相差物镜，与普通目镜配套使用。

　　2、转盘聚光器的调换安装

　　通过相差显微镜旋转聚光器升降螺旋，把普通明视场聚光器至Zdi位，旋松固紧螺丝，卸下聚光器。把转盘聚光器安放到相应位置上，旋紧固紧螺丝，转动聚光器升降螺旋，使聚光器升至Zgao位置。转盘聚光器的标示孔，朝向操作者。此时，转盘聚光器上面的聚光镜部分，进入光路;下面的环状光阑转盘，可视需要转动使用，把与物镜匹配的环孔旋入光路，使之处于转盘聚光镜下。

　　转盘聚光器调换安装后，要进行合轴调中，使聚光器的光轴与相差显微镜的主光轴合一。其步骤如下：

　　①把转盘聚光器的环状光阑调至“0”位，明视场照明的普通可变光阑进入光路。

　　②旋转聚光器升降螺旋，聚光器升至Zgao位。

　　③接通照明光源，使视场明亮。

　　④把被检样品放到相差显微镜载物台上，用低倍(4×)物镜聚焦。

　　⑤缩小镜座上的视场光阑开孔，至Z小。

　　⑥从目镜观察，在暗视场中可见一缩小的、明亮的、多角形的视场光阑图像。

　　⑦转动转盘聚光器的两个调中杆，推动聚光器，把视场中的明亮的多角形的视场光阑图像，调至视场ZY。

　　⑧开放相差显微镜视场光阑至视场同大，视两者周边是否完全重合;否则，复用调中螺杆，使聚光器精神调中。

　　3、绿色滤色镜安装

　　把绿色滤色镜放入相差显微镜镜座的滤色镜架上。

　　4、相板圆环与环状光阑圆环的合轴调中

　　相差显微镜相差物镜的后焦面装有相板。按物镜放大率与反差效果的不同，相板圆环(共轭面)的大小与结构亦不同。转盘聚光器的环状光阑为一系列的透光的，不同大小的明亮环孔，与不同放大率的物镜相应。使用时严格匹配，