超高效液相色谱仪使用方法

超高效液相色谱仪（UHPLC）标准操作规程与性能优化策略

在现代分析实验室中，超高效液相色谱（UHPLC）凭借其的分离效率和极短的分析周期，已成为复杂组分分析的核心工具。要充分发挥UHPLC亚二微米（sub-2 μm）填料颗粒及超高压系统的优势，操作人员必须在系统平衡、溶剂纯度以及死体积控制上具备极其严谨的思维。

系统准备与溶剂管理的严苛要求

UHPLC系统的压力通常可达100 MPa以上，这对流动相的质量提出了近乎苛刻的要求。任何微小的固体颗粒或溶剂杂质都可能导致进样阀磨损、色谱柱堵塞或基线噪音增加。

1. 溶剂级别选择：必须使用色谱级（HPLC Grade）或更高规格的质谱级（MS Grade）溶剂。纯水应经过0.22 μm的滤膜过滤，其电阻率需达到18.2 MΩ·cm。
2. 流动相脱气：即便UHPLC通常配备在线脱气机，但在配制缓冲盐流动相后，仍建议进行超声脱气处理，以防止在高压环境下产生微小气泡，影响泵的排液精度。
3. 色谱柱平衡：由于UHPLC柱管径较细（通常为2.1 mm ID），平衡速度快，但必须确保基线稳定且压力波动在±1.0%以内后方可进样。

UHPLC核心运行参数对比分析

为了直观理解UHPLC与传统HPLC在操作逻辑上的差异，下表列出了关键技术指标的对比参考：

样品前处理与进样策略

在UHPLC操作中，样品的洁净度直接决定了色谱柱的使用寿命。

• 过滤与离心：所有样品在进样前必须经过0.22 μm针式过滤器，或在12000 rpm条件下离心10分钟。对于基质复杂的工业样本，建议进行固相萃取（SPE）或预处理。
• 溶剂兼容性：UHPLC对溶剂效应极其敏感。若样品溶剂洗脱强度显著高于起始流动相，会导致峰展宽或峰分裂。建议尽可能使用起始流动相溶解样品。
• 针洗液配置：为减少交叉污染（Carry-over），应根据目标物的极性设置强、弱两种洗针液，确保进样针内外部在每次循环中均得到充分清洗。

方法转换与管路维护

将传统HPLC方法迁移至UHPLC时，不能仅简单调整流速。需根据Van Deemter曲线调整佳线速度，并依据柱效变化缩减进样量。

系统维护方面，关注以下三点：

1. 定期反冲：若发现系统背压异常升高（超过初始压力20%），在排除保护柱因素后，可尝试在不接检测器的情况下小流速反冲色谱柱。
2. 密封性检查：高压环境下泵密封圈极易磨损。每日观察泵头下方是否有析盐现象，定期执行系统压力测试（Leak Test）。
3. 在线过滤芯更换：泵后方的在线过滤器是保护色谱柱的最后一道屏障。当其前后压差超过5 MPa时，应及时更换。

UHPLC的高效不仅来源于硬件的精密，更依赖于操作者对每一个技术细节的把控。从溶剂的微孔过滤到管路死体积的极限压缩，每一个步骤的规范化，都是确保复杂基质分析重现性与准确性的基础。