细胞破碎方法

　　细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤，破碎方法的得当与否，直接影响到所提取产品的产量、质量和生产成本。实验室对组织细胞的破碎方法很多，有机械方法、物理方法、化学方法和生物化学方法等。

细胞破碎条件

　　在破碎前，材料常需要预处理，如动物材料要除去与实验无关甚至有妨碍的结缔组织，脂肪组织和血污等，植物种子需要除壳，微生物材料需将菌体和发酵液成分分开等。

　　不同实验规模、不同实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。一些坚韧组织，如肌肉、植物的根茎等，常需要强烈的搅拌或研磨作用，才能把其组织细胞破坏。而比较柔软的组织如肝、脑等，用普通的玻璃匀浆器即可达到完全破坏细胞的目的。

　　对同一实验材料，由于实验要求不同，采用的破碎方式也存在一定差异，如提取中的核酸和提取其中的核苷酸，前者必须保持十分温和的条件，以保持分子的完整性;后者可采用强烈手段。

机械法细胞破碎

　　主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法，常用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、压榨器等。

　　1、组织捣碎机

　　将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至Z慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等，转速可高达10000rpm/M以上。由于旋转刀片的机械切力很大，制备一些较大分子如核酸则很少使用。

　　2、匀浆器

　　先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎。匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离。制作匀浆器的材料，除玻璃外，还可以用硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂等。此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

　　存在的问题：较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。

　　3、研钵

　　多用于细菌或其他坚硬植物材料，研磨时常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果。

　　4、细菌磨

　　是一种改良了的研磨器，比研钵具有更大的研磨面积，而且低部有出口。操作时先把细菌和研磨粉调成糊状，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可将细菌细胞完全磨碎。

物理法细胞破碎

　　主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。在生化制备中常用的方法有：

　　1、反复冻溶法

　　原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。

　　方法：将待破碎的细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度引起溶胀，使细胞结构破碎。

　　特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料，对微生物细胞作用较差。

　　2、急热骤冷法

　　将材料投入沸水中，维持85-90分钟，至水浴中急速冷却，此法可用于细菌及病毒材料。

　　3、超声波处理

　　用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，频高于15～20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎。

　　破碎机理：与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及首种类型等因素有关。

　　特点：①操作简单，重复性较好，节省时间;②多用于微生物和组织细胞的破碎。

　　存在问题：超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热均有困难，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。空化作用是细胞破坏的直接原因，同时会产生活性氧，所以要加一些巯基保护剂。

化学及生物化学法细胞破碎

　　1、自溶法

　　在一定pH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系统将。此过程需较长时间，常用少量防腐剂如甲苯、氯仿等防止细胞的污染。

　　2、酶溶法

　　利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解，使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感，加入少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏感而溶解。

　　特点：①此法适用多种微生物;②具有作用条件温和;③内含物成分不易受到破坏;④细胞壁损坏的程度可以控制。

　　存在的问题：易造成产物yi制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。有一定局限性，不适宜大量的蛋白质提取，给进一步纯化带来困难。

　　3、化学渗透法

　　某些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。

　　作用机理：化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。

　　特点：①多用于破碎细菌，且作用比较温和;②提取核酸时，常用此法破碎细胞。

　　存在的问题：时间长，效率低;化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂;通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。

　　无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以YZ或减慢自溶作用;加入碘乙酸可以YZ那些活性zhong心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。