暗场显微镜使用方法

暗场显微镜：揭示微观世界的另一种视角

在精密测量和前沿探索的实验室中，暗场显微镜以其独特的光学设计，为我们揭示了传统明场显微镜难以捕捉的微细结构和低对比度样本。它并非简单地“照亮”样本，而是通过巧妙的光路干涉，将样品本身发出的散射光汇聚，而直接透射光则被阻挡，从而在明亮的背景上呈现出清晰、明亮的样品轮廓。这种“黑地亮星”的成像方式，在生物学、材料科学、质量控制等众多领域展现出不可替代的价值。

暗场显微镜的基本原理与优势

与明场显微镜不同，暗场显微镜的核心在于其遮光盘（Aperture Diaphragm）或暗场聚光镜（Darkfield Condenser）。这些组件的作用是阻挡直射光进入物镜，只允许从样品散射或衍射出来的光线通过。

• 成像原理： 设想一下，在漆黑的房间里，只有一束光照射到悬浮在空气中的微粒上，这些微粒就会因光的散射而发出可见的光芒。暗场显微镜正是利用了这一物理现象。
• 关键优势：
  • 高分辨率与对比度： 对于无色、透明或折射率与周围介质相近的微小颗粒、细菌、血小板、细胞器等，暗场显微镜能提供极佳的对比度，使其轮廓清晰可见。
  • 观察活体样本： 由于成像机制的光照强度相对较低，对活体生物样本的损伤更小，适合观察其动态行为。
  • 无需染色： 避免了染色过程对样本可能造成的损伤和形态改变，尤其适用于需要保持样本原始状态的分析。

暗场显微镜的正确使用步骤

1. 准备工作：

   • 显微镜平台： 确保显微镜稳固放置，电源连接正常。
   • 物镜选择： 通常从低倍物镜开始，逐步放大。在更换物镜时，务必确认聚光镜位置或载物台是否与新物镜兼容。
   • 样本制备：
     • 载玻片与盖玻片： 选用洁净、无划痕的载玻片和盖玻片。
     • 滴加样本： 将待观察样本均匀滴加于载玻片中央，避免气泡。对于活体样本，可使用适当的液体介质。
     • 盖盖玻片： 缓慢滴加盖玻片，防止样本溢出或产生气泡。

2. 暗场聚光镜的设置（核心步骤）：

   • 更换聚光镜： 如果显微镜配备的是旋转式暗场聚光镜，需要将其旋转至暗场档位。许多高级显微镜会内置暗场功能。
   • 调整数值孔径（NA）： 这是暗场成像的重中之重。
     • 使用专用暗场光阑： 对于不带专用暗场聚光镜的显微镜，可以在聚光镜下方插入一个中心遮光盘（Opaque Disc）。遮光盘的直径应略大于对应物镜的焦距。
     • 理想状态： 理想的暗场聚光镜或遮光盘，其设计应能阻挡所有直射光，只允许从样本散射的光进入物镜。
     • 数据参考： 通常，暗场观察配合的物镜NA应大于或等于聚光镜能够提供的最大NA（如果使用聚光镜，NA值会标示在聚光镜上）。例如，若使用40X/0.65NA物镜，需确保聚光镜配合的暗场NA满足或大于0.65。
   • 聚光镜高度调整： 调整聚光镜的高度，使其光轴与物镜光轴对齐。

3. 初步观察与对焦：

   • 亮度调节： 打开光源，并调整至合适的亮度。
   • 粗调与细调： 在低倍镜下，使用粗调和细调旋钮找到样本的初步清晰成像。此时，视野中应是黑暗的背景，样本颗粒呈明亮光点。
   • 聚焦： 仔细调节细调旋钮，直至样本成像最清晰。

4. 精细调整与图像采集：

   • 亮度与对比度优化： 根据需要，微调光源亮度、聚光镜光圈（如果可用，但暗场通常不调节孔径光阑）以及样本的焦距，以获得最佳的视觉效果。
   • 显微镜移动： 使用载物台移动手柄，在视野范围内移动样本，仔细观察细节。
   • 高倍观察： 逐步更换至更高倍物镜，重复聚焦过程。
   • 图像/视频记录： 连接相机或摄像设备，在达到最佳观察效果时，采集高清图像或录制视频。

暗场显微镜使用中的常见问题与解决策略

• 视野背景不黑：
  • 原因： 聚光镜未对准、遮光盘尺寸不匹配、聚光镜NA过低、物镜NA过低、显微镜存在漏光。
  • 解决： 重新对准聚光镜，更换匹配的遮光盘，更换更高NA的物镜或聚光镜，检查显微镜密封性。
• 成像模糊或分辨率不高：
  • 原因： 样本制备不当（厚度不均、气泡），聚焦不准，物镜或目镜不洁，NA值不匹配。
  • 解决： 重新制备样本，仔细对焦，清洁光学部件，确保NA值匹配。
• 观察不到目标：
  • 原因： 样本浓度过低，目标物尺寸小于暗场显微镜的极限分辨能力，光路设置错误。
  • 解决： 增加样本浓度，确认目标物在暗场显微镜的观察范围内，仔细检查光路设置。

结论

暗场显微镜以其独特的成像方式，为我们打开了观察微观世界的新窗口。掌握其原理和正确的使用方法，能够显著提升我们在生命科学、材料分析、医学诊断等领域的探索效率和研究深度。对于从业者而言，熟练运用暗场显微镜，意味着能够更地捕捉细节，更深入地理解样本特性，从而在激烈的科研和产业竞争中，始终处于技术的前沿。