蛋白电泳操作规程

蛋白电泳操作规程：分离的关键步骤

蛋白电泳作为一种分离和鉴定蛋白质的重要技术，在生命科学、医学诊断、食品安全以及工业质量控制等领域有着广泛的应用。准确规范的操作是保证实验结果可靠性的基石。本文旨在为实验室、科研、检测及工业从业者提供一份详尽的蛋白电泳操作规程，并辅以关键数据和注意事项，助您高效、地完成蛋白分离。

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）

SDS-PAGE 是常用的蛋白电泳技术之一，其基本原理是利用 SDS 这种阴离子去污剂使蛋白质带上均匀的负电荷，然后在聚丙烯酰胺凝胶的电场中，蛋白质的迁移速率主要取决于其分子量。

凝胶配制

• 重要参数： 凝胶浓度直接影响分离范围，低浓度（如 7.5%-10%）适用于分离大分子量蛋白，高浓度（如 12%-15%）则更适合分离小分子量蛋白。梯度凝胶（如 4%-15%）能提供更宽的分离范围。
• 配制示例（10% SDS-PAGE 凝胶）：
  • Acr/Bis (30% Acrylamide/0.8% Bis-acrylamide) 溶液： 33.3 mL
  • 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 溶液： 25.0 mL
  • SDS (10%) 溶液： 10.0 mL
  • 去离子水： 31.7 mL
  • TEMED： 0.05 mL
  • APS (10%) 溶液： 0.5 mL
  • 注意：TEMED 和 APS 应在最后加入，并充分混匀，以引发聚合反应。
  
  
• 操作流程：
  1. 将 Acr/Bis 溶液、Tris-HCl 缓冲液、SDS 溶液和去离子水加入烧杯中，轻轻搅拌。
  2. 加入 TEMED 和 APS 溶液，快速混匀。
  3. 将混合液倒入电泳槽的模具之间，用梳子制作泳道。
  4. 待凝胶完全聚合（约 30-60 分钟），移除梳子，用去离子水彻底冲洗梳子孔，去除未聚合的单体。
  
  

样品制备

• 关键步骤： 样品需与上样缓冲液（通常含 SDS、还原剂如 DTT 或 β-巯基乙醇、甘油和染料如溴酚蓝）混合，并在沸水中煮 5-10 分钟。SDS 破坏蛋白质的三级和四级结构，还原剂断裂二硫键，甘油增加样品密度以便顺利上样。
• 建议： 对于不稳定或易降解的蛋白质，可采用冷上样或缩短煮样时间。

电泳运行

• 电压与电流： 恒压或恒流是两种常用的电泳模式。
  • 恒压： 通常设置为 80-150 V，运行时间 1.5-3 小时，直至染料前沿接近凝胶底部。
  • 恒流： 根据凝胶尺寸和缓冲液导电性设定，如 20-30 mA。
  
  
• 缓冲液： 推荐使用 Tris-甘氨酸-SDS 缓冲液（pH 8.3），其离子强度和 pH 值在电泳过程中能保持相对稳定。
• 温度控制： 避免过高的温度升高，以防蛋白质变性或凝胶熔化。建议在 4°C 的冷室或使用电泳槽冷却装置进行电泳。

染色与成像

• 常用染料： 考马斯亮蓝 R-250 是最常用的蛋白质染料，具有高灵敏度和良好的线性关系。
• 染色步骤：
  1. 电泳完成后，将凝胶从模具中取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色 30 分钟至数小时。
  2. 用脱色液（如乙醇/乙酸/水）脱色，直至背景变浅，蛋白质条带清晰可见。
  
  
• 数据记录：
  • 分子量标记： 使用已知分子量的蛋白标准品（Marker）进行对照，确定目的蛋白的分子量。
  • 图像采集： 使用凝胶成像系统或扫描仪对染色后的凝胶进行成像，并进行定量分析。
  
  

其他电泳技术简介

• Native-PAGE（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）： 不使用 SDS 和还原剂，蛋白质在天然状态下分离，迁移速率受电荷、大小和形状共同影响，适用于研究蛋白质复合物、酶活性等。
• 等电聚焦电泳 (IEF)： 利用蛋白质的等电点（pI）在 pH 梯度中进行分离，适用于确定蛋白质的 pI 值或分离具有相似分子量但 pI 不同的蛋白质。
• 双向电泳： 通常是将 IEF 和 SDS-PAGE 结合，实现对蛋白质更精细的分离和鉴定，是蛋白质组学研究中的常用技术。

质量控制与问题排查

• 条带弥散： 可能原因包括样品制备不当、电泳电压过高、凝胶聚合不完全等。
• 条带模糊： 可能是染料前沿过快、煮样时间不足或蛋白质降解。
• 无条带： 检查电泳仪、缓冲液、样品是否正确，以及染料是否加入。

掌握蛋白电泳的原理和精细操作，不仅能为您带来高质量的实验数据，更能成为您在科研和生产过程中解决问题的有力武器。持续的学习和实践，将使您在蛋白电泳领域游刃有余。