凝胶电泳仪使用方法及影响因素

凝胶电泳仪的用途一般是分析，然而其还能够用来制备。在采用聚合酶链式反应(PCR)、DNA测序或者免疫印迹、克隆技术、质谱MS之前先对分子部分提纯。

原理

支撑物为凝胶(如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等)的区带电泳。

使用方法

该技术不但操作步骤简单和速度快，还能够对用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段进行分辨。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,,在紫外光下至少能够将1-10ng的DNA条带检出，从而能够使得DNA片段在凝胶中的位置确定。除此以外，其还能将特定的DNA条带从电泳后的凝胶中回收，在之后的克隆技术操作中使用。

电泳分类

根据支持物的物理性状不同,可以将电泳分为

(1)凝胶电泳:如琼脂,琼脂糖,硅胶,淀粉胶,聚丙烯酰胺凝胶电泳

(2)缘线电泳:如尼龙丝,人造丝电泳

(3)纸电泳：滤纸为支持物的纸电泳

(4)粉末电泳: 如纤维素粉,淀粉,玻璃粉电泳

影响因素

琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:

1、 电源电压

在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段有效分离所加电压不得超过5V/cm。

2、嵌入染料的存在

琼脂糖凝胶中的DNA可以使用荧光染料溴化乙啶来检测，染料会在堆积的碱基对之间嵌着，增强了其强性还会降低线状DNA迁移率。

3、离子强度影响

DNA的电泳迁移率受到　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响。在离子不存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率Z小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),有很高的热传导性并且产热明显，如果严重旧货导致凝胶熔化或DNA变性。对于天然的双链DNA,TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA为常用的几种电泳缓冲液，通常将其配制成浓缩母液,在室温下储存。

4、 琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA分子,在不同浓度的琼脂糖凝胶中其迁移速度各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。DNA分子的大小决定了凝胶浓度的选择。分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

5、DNA分子的构象

当DNA分子处于不同构象时,，它在电场中移动距离不仅受到分子量的影响，而且受到它本身构象的影响。在琼脂糖凝胶中，在琼脂糖凝胶中的移动速度各不相同，开环双链DNA移动Z慢，而超螺旋DNA移动Z快。

6、 DNA的分子大小

在一定浓度琼脂糖凝胶中线状双链DNA分子的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大就会受到越大的阻力，在凝胶孔隙中蠕行也就变得越困难，所以迁移得越慢。