超高效液相色谱仪操作规程

超高效液相色谱仪（UHPLC）标准化操作规范与技术核心

在现代分析实验室中，超高效液相色谱仪（UHPLC）凭借其的分离能力、极高的检测灵敏度以及显著缩短的分析周期，已成为复杂组分分析的标配。UHPLC在超高压（通常可达1000 bar以上）和亚2微米填料色谱柱的运行环境下，对操作的精细化程度要求远高于传统HPLC。本文旨在分享从业者在日常操作中沉淀的核心规程。

核心原理与硬件适配要求

UHPLC的核心在于通过减小固定相颗粒直径（通常为1.7μm - 1.9μm）来提升柱效。根据范第姆特方程（Van Deemter equation），粒径减小可显著降低传质阻力。但这伴随着背压的剧烈升高。因此，系统中的每一个连接点、管路死体积以及进样器的密封性，都会直接影响色谱峰的对称性和重复性。

启动前置准备：溶剂与流动相管理

UHPLC对污染极其敏感。操作者必须使用LC-MS级或超纯级溶剂，并严格执行以下标准：

1. 过滤要求：所有水相缓冲液必须使用0.22μm的有机系或水系微孔滤膜过滤，以防微小颗粒堵塞单向阀或色谱柱。
2. 脱气处理：系统内置脱气机虽然高效，但对于高比例水相，建议先进行超声脱气15-20分钟，避免高压下析出微小气泡导致压力波动。
3. 溶剂效期：含盐缓冲液建议现配现用，放置时间不得超过24小时，以防止微生物生长干扰基线。

运行中的关键参数监控

进入正式分析前，必须对系统进行充分平衡。观察压力曲线的稳定性是判断系统状态的首要标准。

表1：UHPLC运行关键技术参数参考标准

样品处理与进样规范

样品基质的复杂性是造成UHPLC柱压升高甚至堵塞的主要原因。

• 离心预处理：所有待测液必须在12,000 rpm下离心至少10分钟。
• 进样量控制：由于UHPLC柱容量较小，进样量一般控制在0.5μL - 5μL之间。过大体积的进样会导致溶剂效应，造成峰展宽。
• 溶剂强度匹配：样品溶剂的强度应等于或小于初始流动相强度，否则会出现早出峰畸变。

关机程序与色谱柱维护

实验结束后的冲洗是不容忽视的环节，这决定了仪器的使用寿命。

1. 含盐流动相置换：若使用了缓冲盐，必须先用10%甲醇水（或乙腈水）冲洗系统管路及色谱柱至少30分钟，防止盐析晶体磨损泵密封圈或堵塞针座。
2. 柱保存：长期存放时，色谱柱应保存在纯有机溶剂（如纯乙腈或甲醇）中。
3. 压力释放：关机前应缓慢降低流速，直至压力降至常压附近再关闭电源，避免压力骤降对单向阀陶瓷球产生冲击。

总结

超高效液相色谱仪的高性能表现建立在严格的操作纪律之上。从溶剂等级的甄别到进样前处理的严谨，每一个细节的偏差在超高压系统中都会被放大。通过标准化操作，不仅能保障数据的一致性与准确性，更能大幅降低停机维护成本，提升实验室的整体研发效率。