相衬显微镜操作步骤

本文聚焦相衬显微镜的系统操作步骤，围绕如何在不损伤样品的前提下，通过规范的光路对准、精确的对比调控与稳定的成像流程，获得清晰、高对比的显微图像。文章覆盖从设备准备、光路校准、样品制备到图像获取与日常维护的全流程，帮助操作者建立标准化的工作方法。

1) 准备与安全 在正式观察前进行场地与设备的准备。检查显微镜与光源的完好，温度、湿度符合实验室要求；确保工作台清洁，镜头、物镜、偏振片无尘污迹。样品应按实验规程制备，使用合适的载玻片和盖玻片，必要时加封边防止干燥。取材前分析样品的对照与对比需求，确保后续成像可重复、可比。

2) 开机、光路对准与清洁 开机前让光源稳定若干分钟，轻微旋转粗调焦轮以初步聚焦。清洁光学元件，尤其是偏振片、分析器、棱镜入口与出口面。将样品放置在载台上，确保光路进入物镜中心。初步对准时先用低放大倍数物镜，调整聚光器、对准器和聚光镜，确保光线沿光路直线进入棱镜系统。

3) 极化与分析器的对位与相差对比设定 相衬显微镜核心在于偏振光的分离与再合成。先调整偏振器角度，使进入样品区的光具有稳健的线偏振；随后微调分析器位置，使背景尽量均匀、对比度处于可控区间。若系统配置了Nomarski棱镜/ Wollaston棱镜，需缓慢调整棱镜的倾角与相位差，使边界处出现清晰的三维轮廓与阴影效果，同时避免过亮或失真。

4) 物镜选择与样品对齐 选择高数值孔径物镜以获得更高的对比度与分辨率，常用的有1.3NA及以上的油镜或城市水耦合镜。根据样品厚度与对比需求，设置合适的工作距离与拍摄范围。样品在载玻片上应水平放置，必要时使用润滑剂或湿盒保持样品环境稳定，避免干燥引入对比度波动。

5) 对比度优化与聚焦 在低放大下完成对焦后，逐步转入高放大倍率观察。通过微调棱镜角度、片层厚度与对比度控制螺丝，获得清晰的轮廓明暗分布。注意观察区域的均匀性，避免非对称光照导致的伪影。对于动态样品，需进行时间稳定性评估，确保长时间成像中的对比度稳定。

6) 采集影像与参数记录 确定成像参数：光源强度、曝光时间、增益、对比度等级及拍摄分辨率。尽量在一致的条件下进行系列拍摄，以便后续分析和比对。保存原始数据与处理参数，建立实验日志，记录样品信息、放大倍数和环境条件，确保结果可溯源。

7) 日常维护与故障排查 使用完毕后清洁镜头与取景部件，关机前让系统冷却。定期检查偏振片、分析器的角度标定，记录任何对比度漂移现象；若发现图像出现条纹、模糊或色差，优先排查光路对准、棱镜位移与物镜清洁状态。建立定期维护计划，确保设备长期处于良好工作状态。

通过严格遵循上述操作步骤并结合日常维护，能够稳定地产出高对比、可重复的相衬显微图像。