蛋白电泳测试标准

更新时间：2025-12-31 18:15:25 类型：行业标准阅读量：36

导读：因此，建立并遵循严谨的测试标准至关重要。本文旨在为实验室、科研、检测及工业从业者提供一份详尽的蛋白电泳测试标准指南，涵盖关键参数、数据分析及质量控制等环节，助您在实践中达到更高水平。

蛋白电泳测试标准：深度解析与实践指南

蛋白电泳作为生命科学、生物技术、制药、食品安全以及材料科学等领域不可或缺的分析技术，其结果的准确性和可重复性直接关系到科研的进展和产品的质量。因此，建立并遵循严谨的测试标准至关重要。本文旨在为实验室、科研、检测及工业从业者提供一份详尽的蛋白电泳测试标准指南，涵盖关键参数、数据分析及质量控制等环节，助您在实践中达到更高水平。

H2 SDS-PAGE 分离标准

聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是分离蛋白的常用技术，其标准的建立主要围绕以下几个关键要素：

凝胶配制：
- 聚丙烯酰胺浓度： 凝胶的孔径直接影响蛋白的迁移速度和分离效率。通常，8%~15%的凝胶适用于分离分子量范围在10 kDa至200 kDa的蛋白。例如，一个10%的凝胶（基于总的单体浓度）通常能有效分离分子量在30 kDa至100 kDa范围内的蛋白，而15%的凝胶则更适合分离10 kDa至50 kDa的小分子量蛋白。
- 交联度： 胶的交联度（通常为Tgcd/Tgd的比例，如2.6%）影响凝胶的机械强度。过高的交联度可能导致凝胶变脆，而过低的交联度则会影响分辨率。
- 缓冲体系： Tris-Glycine (pH 8.3) 是经典的两相缓冲体系，常用于SDS-PAGE。Tris-Tricine 缓冲体系（pH 8.3）则更适合分离小于20 kDa的小分子量蛋白。
样品制备：
- 蛋白浓度： 确保样品蛋白浓度适宜，过高或过低都会影响电泳效果。一般推荐的蛋白加载量范围为10 µg至50 µg，具体取决于蛋白丰度和检测灵敏度。
- 上样缓冲液： 含有SDS（十二烷基磺酸钠）以使蛋白变性并获得一致的负电荷，β-巯基乙醇或DTT（二硫苏糖醇）用于还原二硫键，甘油增加溶液密度便于加样，溴酚蓝作为指示剂。
电泳条件：
- 电压/电流： 恒压或恒流电泳是常用的模式。恒压（如100-150V）下，电流会随电泳进程下降；恒流（如20-30mA）下，电压会随之升高。稳定且可控的电压/电流是获得良好分离度的前提。
- 电泳时间： 根据凝胶尺寸、蛋白分子量和电泳条件确定。通常，当溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部约2/3处时，电泳可考虑停止。
- 温度控制： 推荐在4°C低温下进行电泳，以降低蛋白降解风险并提高分离度。

H2 Western Blot 检测标准

Western Blot 是基于SDS-PAGE分离蛋白后，通过特异性抗体检测目标蛋白的技术。其标准化涵盖了从转膜到显影的每一个环节：

转膜效率：
- 转膜方法： 湿转、半干转、干转等。湿转在4°C下，使用0.1% SDS和20%甲醇的转膜缓冲液，通常能提供最高的转膜效率，特别是对于大分子量蛋白。
- 转膜时间与电压： 根据蛋白分子量和膜的类型（PVDF或NC膜）进行优化。例如，对于100 kDa以上的蛋白，可能需要过夜转膜或较高电压（如100V，1-2小时）。
- 转膜效率评估： 可通过预染蛋白分子量标准进行直观判断，或通过后续的Ponceau S染色进行定性评估。
封闭：
- 封闭液： 常用5%脱脂奶粉或3% BSA（牛血清白蛋白）的TBST（Tris-buffered saline with Tween-20）溶液。BSA更适合检测磷酸化蛋白，因为奶粉中可能含有磷酸化的酪蛋白。
- 封闭时间： 通常为1小时，可在室温或4°C过夜进行。
一抗和二抗孵育：
- 抗体稀释度： 必须根据生产商推荐和实验验证进行优化。例如，一抗稀释度可能在1:1000至1:5000，二抗则在1:5000至1:20000。
- 孵育条件： 通常在4°C孵育过夜或在室温下孵育1-2小时。
显影与定量：
- ECL底物： 化学发光底物的选择和孵育时间会影响信号强度和背景。
- 图像采集： 使用合适的成像设备，并根据信号强度调整曝光时间，避免信号饱和。
- 定量分析： 使用专业的图像分析软件（如ImageJ），对条带灰度值进行定量，并进行背景校正。内参蛋白（如GAPDH, β-actin）的表达水平应与目标蛋白进行比较，以校正上样量差异。