暗场显微镜教程

更新时间：2025-12-26 18:15:24 类型：教程说明阅读量：27

导读：暗场显微镜，正是这样一种能够“化腐朽为神奇”的光学仪器。它巧妙地利用光路设计，将背景调至漆黑一片，仅将样品本身因散射、衍射或折射而偏离原有光路的“细节”投射到观察者眼中。这使得原本在明场显微镜下难以辨认的微小颗粒、细菌、晶体结构甚至细胞器，都能呈现出清晰、高对比度的亮丽影像。

暗场显微镜：探秘微观世界的利器

在精密科学研究与工业检测的领域，我们常常需要洞悉肉眼无法企及的微观细节。暗场显微镜，正是这样一种能够“化腐朽为神奇”的光学仪器。它巧妙地利用光路设计，将背景调至漆黑一片，仅将样品本身因散射、衍射或折射而偏离原有光路的“细节”投射到观察者眼中。这使得原本在明场显微镜下难以辨认的微小颗粒、细菌、晶体结构甚至细胞器，都能呈现出清晰、高对比度的亮丽影像。

暗场显微镜的工作原理浅析

与传统的明场显微镜不同，暗场显微镜的核心在于其特殊的聚光镜。普通聚光镜将光线聚焦于样品平面，而暗场聚光镜则设计了一个不透光的遮挡盘。当光源穿过遮挡盘外围的光圈后，光线并非直接进入物镜，而是以一个较大的倾斜角度照射在样品上。

散射原理： 样品中的微小结构（如细菌鞭毛、病毒颗粒、悬浮微粒）对光线具有散射作用。这些被散射的光线，如果其偏离了中央遮挡盘的范围，便能被物镜捕捉并放大，形成亮丽的图像。
无散射区域： 而那些没有被散射的直射光线，则被中央遮挡盘完全阻挡，无法进入物镜。因此，观察视野的背景呈现为纯粹的黑暗。

这种“反其道而行之”的光学设计，极大地提高了对微弱散射光的敏感度，从而在极暗的背景下凸显出微小的、透明的或折射率与周围介质差异不大的目标。

暗场显微镜的关键技术参数与配置

要实现高质量的暗场成像，以下几个关键参数和配置至关重要：

聚光镜类型： 常见的有使用独立暗场聚光镜（例如，带中央遮挡盘的阿贝聚光镜或康德聚光镜）或集成在物镜内的暗场滤光片。选择合适的聚光镜直接决定了其能够支持的物镜数值孔径（NA）。
数值孔径 (NA)： 聚光镜和物镜的数值孔径必须匹配。通常，暗场观察需要较高的NA，以收集更多散射光。例如，配合高NA物镜（NA ≥ 0.75），需要相应的高NA暗场聚光镜。
光源强度： 暗场成像对光源强度有较高要求，以补偿被散射光线能量的衰减。LED光源因其高亮度、长寿命和色温稳定性，已成为主流选择。
显微镜载物台： 精密的载物台（如机械载物台）对于精确定位和观察微小样本至关重要。
相机与图像采集系统： 高灵敏度、低噪声的相机能够捕捉到微弱的散射信号，获得高质量的暗场图像。

暗场显微镜的应用领域与优势

暗场显微镜凭借其独特的成像优势，在多个行业得到了广泛应用：

生命科学领域：
- 细菌形态学研究： 观察细菌的鞭毛、细胞壁结构、运动状态等，尤其适用于观察难以染色的活体细菌。
- 病毒学研究： 观察病毒颗粒的形态和聚集情况。
- 细胞学研究： 观察细胞器的细微结构，如线粒体、内质网等，以及细胞骨架。
- 血液学分析： 观察血细胞的形态和异常，如血小板聚集。
- 微生物生态学： 研究水体、土壤等样本中的微生物群落。
材料科学与工业检测：
- 颗粒物分析： 检测和分析悬浮微粒、尘埃、污染物颗粒的大小、形状和分布。例如，在半导体制造过程中，检测晶圆表面的微小颗粒。
- 表面缺陷检测： 检查材料表面划痕、凹痕、杂质等微小缺陷。
- 晶体学研究： 观察微小晶体的生长和形貌。
- 薄膜分析： 检测薄膜表面的微观结构和均匀性。

优势总结：

高对比度成像： 极暗的背景能够清晰衬托出微弱的细节。
非染色观察： 允许观察活体生物样本，避免染色剂对细胞活性的影响。
检测微小结构： 对微小、透明或折射率差异不大的物体具有极佳的显示效果。
增强细节分辨率： 有时能比明场显微镜显示出更多细微结构。

暗场显微镜的实际操作要点

在进行暗场观察时，有几个关键步骤和注意事项：

聚光镜调试：
- 将聚光镜置于与物镜匹配的NA位置。
- 插入中央遮挡盘，确保其尺寸与所选物镜的视野大小相匹配。
- 调整聚光镜高度，使照明光锥中心与物镜光轴对齐。
- 重要提示： 观察者应能看到一个均匀黑暗的视野，如果看到明亮背景或不均匀的光斑，说明聚光镜未正确对准。
光源调节：
- 将光源亮度调整到合适水平，既能看清细节，又不过于刺眼。
- 保持光源稳定，避免闪烁。
样本放置与聚焦：
- 将待观察的载玻片放置在载物台上，并用夹子固定。
- 初步使用低倍物镜（若使用多功能聚光镜）和明场模式找到样本区域。
- 切换到目标物镜，然后打开暗场照明。
- 仔细调节焦距，直到样品细节清晰呈现。
相机设置：
- 根据需要调整相机的曝光时间、增益和白平衡。暗场成像通常需要较长的曝光时间来捕捉微弱信号。