DNA合成反转录介绍和应用

反转录PCR（Reverse Transcription，RT-PCR）又叫做逆转录PCR。将组织或细胞中的总RNA提取出来，模板使用其中的mRNA，利用逆转录酶，采用随机引物或Oligo(dT)反转录成cDNA，模板再使用cDNA进行PCR扩增来对基因表达进行检测，或者使目的基因获得。

介绍

特异性引物

引物使用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸是Z为特异的引发方法。如果两种特异性引物为PCR反应所使用，利用与mRNA 3’端Z靠近的配对引物作为第yi条链的合成的起始。用此类引物只会有所需要的cDNA产生，使得PCR扩增更为特异。

随机六聚体引物

当有可以使反转录酶终止的序列在特定mRNA时，从而使得对其全长序列进行复制很困难，全长mRNA的复制能够通过随机六聚体引物这一不特异的引物来进行。当使用该方法时，全部cDNA第yi链模板由体系中所有RNA分子所充当，在扩增过程中，所需要的特异性赋予给了PCR引物。rRNA一般作为用此引物合成的cDNA的96%的来源。

Oligo(dT)

为一种对mRNA特异的方法。由于3’端Poly(A )尾为绝大多数真核细胞mRNA所具有，当其配对Oligo(dT)的时候，只能够转录mRNA。因为在总RNA中，Poly(A )RNA只有1-4%的比例，所以和随机六聚体作为引物和得到的cDNA相比较，此种引物合成的cDNA得到更少的数量和更为简单。

1、嗜热微生物的热稳定性反转录酶：

在存在Mn2下，高温反转录RNA被允许，用来对RNA模板的二级结构进行消除。

2、MMLV反转录酶的RNase H-突变体：

和其它酶相比较，更大部分的RNA能够由此种酶被转换成cDNA，这一特性为从不易低温反转录、含二级结构的mRNA模板使较长cDNA合成所允许。

3、Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：

37℃是Z合适的作用温度，有着相对比较弱的RNA酶H活性，聚合酶活性比较强。

4、 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：

42℃是Z合适的作用温度，RNA酶H活性和聚合酶活性都比较强。

应用

RNA检测的灵敏性由于RT-PCR提高了几个数量级，提供了一些可能性对于分析一些极为微量RNA样品。RNAGX转录系统的构建、cDNA探针的合成、目的基因的获取以及基因的转录产物的分析为该技术的应用

RT- PCR即逆转录PCR，是结合了cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）和RNA的逆转录（RT）的技术。RT-PCR技术有着广泛的用途并且非常的灵敏。能够被用来对特定基因的cDNA序列直接克隆以及对细胞中RNA病毒的含量和细胞/组织中基因表达水平进行检测等。