免疫印迹法三个阶段

免疫印迹法 (Western blotting) 是一种结合了免疫化学分析和技术高分辨率凝胶电泳的杂交技术。免疫印迹法是对蛋白质特性、表达与分布进行检测Z常用的一种方法，例如病毒的抗体或抗原检测、多肽分子的质量测定与组织抗原的定性定量检测。免疫印迹法具有很强的特异性，很高的敏感度以及很大的分析容量。免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)也叫做酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB),由于其类似于Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot ，因此也被叫做Western-blot。

阶段

免疫印迹法的进行包括三个阶段

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）为diyi个阶段。经过SDS的处理，抗原等蛋白样品带有负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中，由阴极向阳极泳动，分子量与泳动速度成反比，肉眼不能观察出该阶段分离的效果（电泳区带只有染色后才能被显示出来）。

电转移：

第二阶段为电转移。往硝酸纤维素膜上转移在凝胶中已经分离的条带，选择大电流（1～2A）以及低电压（100V），通电45分钟就能够完成转移。肉眼依然不能观察出该阶段分离的蛋白质条带。

酶免疫定位：

酶免疫定位为第三阶段。依次将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）特异性抗体和酶标第二抗体作用后，将可以使得不溶性显色物形成的酶反应底物，使区带染色。4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）和3,3'-二氨基联苯胺（呈棕色）为常用的HRP底物。能够清晰辨别阳性反应的条带，并且能够通过SDS-PAGE时加入的分子量标准，将各组分的分子量确定出。该方法是将ELISA法的高特异性和敏感性和SDS-PAGE的高分辨力相结合，分析手段非常有效，除了能够在分析抗原组分及其免疫活性方面得到广泛地应用，而且在疾病的诊断方面也能够使用。在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。抗原经电泳在硝酸纤维素膜上转移后，将膜切成小条，与显色底物制成的试剂盒和酶标抗体相结合，在实验室中为检测提供了方便。有无针对病毒的特异性抗体能够通过出现显色线条的位置判断出来。