小核酸药物定量新势力，且看HRMS！

治 疗性寡核苷酸作为一类新兴的治 疗方式，其潜力被不断挖掘，并引领着全 球研发浪潮。随着寡核苷酸领域质谱应用的日渐增加，已经配备HRMS用于寡核苷酸分子表征的实验室也越来越关注HRMS的定量分析功能。HRMS方法不仅具有收集定性数据的能力，同时还可以为现代生物分析实验室提供额外的选择性方案和采集分析模式（包括DIA、DDA和Target MS/MS等），此外，HRMS定量性能的拓展还能进一步提高实验室设备的利用率。

本次分享的案例采用了寡聚核苷酸标准品以及GEM91（⼀种全硫代磷酸化反义寡核苷酸，结构见图1），对Xevo G2-XS QTof HRMS平台在寡核苷酸分析中的性能进行评测，并与经典的三重四极杆平台定量方法进行了典型的生物分析性能指标比较。

图1. 全硫代磷酸化寡核苷酸反义药物GEM91

对HRMS和MRM方法使用的MS母离子和碎片离子见表1（OST标准品与GEM 91的电荷和m/z）。HRMS分析对m/z 700应用了靶向增强，增加目标质量数附近50 ‒ 100 Da质量范围的灵敏度。每个平台均使用强度更高的电荷峰簇，提供适度的性能优势。通常，多有2 ‒ 3个电荷峰簇的丰度较高，可以根据背景离子的性质和干扰进行选择。

表1. 寡核苷酸分析使用的MS母离子和碎片离子更多分析物的信息。

HRMS可以表征寡核苷酸分子（识别不同的同位素/电荷态），并选择能实现良好定量灵敏度、选择性和准确度的最 优同位素/电荷态。在方法开发过程中可能会监测多个离子。如果首 选离子受到干扰，可以轻松选择不同峰簇或同⼀峰簇内的其他同位素。HRMS还能同时监测或定量杂质、代谢物和加合物，并提供更多关于分析质量的信息，以及关于样品本身潜在干扰和变化的额外信息。

图2. 25-mer OST标准品(OST (25T))不同电荷态峰簇的代表性谱图。

图3. 用于OST (25T)定量的[M-10H]-10电荷态峰簇的放大图。

图4. 用于GEM 91定量的[M-11H]-11电荷态峰簇的放大图。

选择性的质量数提取窗口提高分析选择性

如图5a和5b所示，使用HRMS用于寡核苷酸分析能够提取窄质量数窗口，从而大幅提高分析的选择性，这体现了HRMS的高质量精度优势。如图所示，使用0.2 Da的质量数提取窗口可获得理想信噪比(S/N)和优异的总体灵敏度。QTof使用能够选择适合分析和微调选择性的质量数提取窗口(MEW)。图5a和5b表明，⼀般而言，0.2 Da是这些分析物的良好起点，可提供理想S/N。

图5a. GEM 91的代表性色谱图，凸显了在Xevo G2-XS QTof MS上使用0.02 ‒ 2.0 Da内不同质量数提取窗口时，HRMS方法的灵敏度和专属性。

图5b. 使用0.2 Da的MEW时，不同QC水平的灵敏度和专属性。

与经典三重四极杆定量比较，能力如何？

通过对OST(25T)和GEM 91在HRMS或MRM不同分析平台定量获得的标准曲线性能进行对比，如表2 ‒ 表4所示。两种质谱仪的定量下限(LLOQ)均为1 ng/mL; QTof的动态范围为1 ‒ 1,000 ng/mL, 串联质谱仪的动态范围为1‒10,000 ng/mL。标准曲线呈现线性，r2值>0.99（1/x2加权），所有校准点的平均准确度在88% ‒ 108%之间。寡核苷酸OST和GEM 91的质量控制(QC)性能报告见表4 ‒表 5，平均准确度在81% ‒ 110%之间，CV在0.2% ‒ 10.1%之间。总体而言，HRMS性能与在Xevo TQ-XS三重四极杆上观察到的MRM定量数据相当。

表2. 在Xevo G2-XS QTof MS上分析GEM 91和OST (25T)的线性动态范围。

表3. 使用Xevo TQ-XS三重四极杆分析GEM 91和OST得到的QC样品统计数据。

表4. 使用Xevo G2-XS QTof MS分析GEM 91和OST得到的QC样品统计数据。

如何借助色谱前端，让质谱灵敏度更上层楼？

在寡聚核苷酸分析方法开发的过程中，由于寡核苷酸的阴离子性质与色谱柱不锈钢及其它金属表面引起的非特异性吸附往往导致样品峰损失/变形，使得寡聚核苷酸分析方法的开发十分棘手。本次实验色谱分离使用ACQUITY Premier BSM系统装配ACQUITY Premier C18寡核苷酸分析专用柱完成。ACQUITY Premier色谱柱搭载MaxPeak高性能表⾯(HPS)技术，能够大幅减少非特异性结合并改善峰形、回收率以及分析方法的整体重现性。HPS技术专为尽量减少金属表面与分析物（例如：寡核苷酸、磷酸肽、小分子有机磷酸酯及其他对金属表⾯表现出很强亲和力的分析物）之间的相互作用而开发。

图6. 与标准ACQUITY UPLC I-Class系统和标准UPLC⾊谱柱相比，使用ACQUITY Premier系统和ACQUITY Premier色谱柱对GEM91分析展现出更高的色谱性能。

总结

1、满足需求的HRMS定量模式

• Xevo G2-XS QTof MS已被证明是⼀个灵敏平台，能够在多种采集模式下生成高质量LC-MS定量数据，为可定量的峰提供多种选择；
  

• 该平台可通过MEW微调选择性，并选择适合分析的同位素/电荷态；

• 本次测试的实验数据表明，Xevo G2-XS QTof MS在保证线性、准确度和精密度的情况下，寡核苷酸分析的灵敏度可以达到1 ng/mL，满足定量需求。

2、可信赖的的色谱分离结果

• ACQUITY Premier LC系统装配ACQUITY Premier C18寡核苷酸分析专用柱是提高棘手分析物的回收率和分析检测限的重要工具；

• ACQUITY Premier技术的使用有助于减少金属吸附，保证生物分析方法发挥稳定和灵敏的定量性能。

被业界广泛应用的Xevo表征与定量平台联合新发布的高性能表面技术(HPS) Premier系统，可帮助加快研发周期，推进小核酸药物产业化进程。

参考资料

1.Mark W, Suma V. (2021). 使用Xevo G2-XS QTof质谱仪对寡核苷酸进行HRMS定量. 沃特世应用纪要, 720007391ZH.

2.Kathryn B, Mary T, Paul D. R. (2021). 利用ACQUITY Premier系统和⾊谱柱改善寡核苷酸生物分析的色谱性能. 沃特世应用纪要, 720007119ZH.