热点应用丨走进微区视野——爱丁堡显微荧光光谱

荧光显微镜是一种利用荧光的成像技术，通过内在发射或人工添加荧光团，以提供与显微镜图像的对比。在生物医学成像中，由于使用多种荧光标记，不同的荧光团可用于同时识别特定的目标分子和细胞结构，提供高度的特异性和选择性。在材料科学中，荧光(光致发光)显微镜可以用来观察发光纳米粒子和半导体表面缺陷的图像。

Fig. 1 Composite Widefield fluorescence image of bovine pulmonary artery endothelial (BPAE) cells acquired using the FS5 Spectrofluorometer with microscope add-on.

荧光显微镜可以获取详细的细胞图像，如图1所示的牛肺动脉内皮(BPAE)细胞。BPAE细胞含有血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme, ACE)，它是通过收缩和扩张血管来调节血压的重要成分。在这个BPAE样品中，不同的细胞成分被用不同颜色的荧光染料标记，以便观察细胞的结构。本文将详细说明使用爱丁堡仪器FS5荧光光谱仪和显微镜附件获得像上述BPAE的荧光图像，以及发射光谱和寿命衰减光谱。

实验部分

样品来自Invitrogen公司的FluoCells™制备的玻片#1，其中含有牛肺动脉内皮(BPAE)细胞。BPAE细胞用不同的荧光染料的染色标记，不同染料针对细胞中的特定结构。MitoTracker®Red CMXRos标记线粒体（红色），Alexa Fluor®488 phalloidin用于标记丝状肌动蛋白（绿色），DAPI用于标记细胞核（蓝色）。

Fig. 2 FS5 Spectrofluorometer coupled to a fluorescence microscope.

文中所有的测试使用爱丁堡仪器FS5荧光光谱仪与尼康Ni-U正置荧光显微镜耦合实现。FS5通过装载液体光导台，激发和发射光通过液体光导与显微镜耦合。FS5配置稳态激发的150W氙灯， TCSPC寿命模块，及电制冷PMT-980探测器。该实验中的显微镜配置CMOS荧光成像相机进行宽场视野的荧光成像，激发和发射侧光谱液体光导耦合接口，以及用于耦合爱丁堡皮秒脉冲激光器EPL-37的激光器耦合接口。

测试结果

荧光宽场成像图 

为了获得BPAE细胞的宽场荧光图像，将FS5和显微镜进行耦联。激发光源为FS5的150 W稳态Xe灯，使用SC-50光导样品台将激发单色器选择的所需波长导入至激发侧液体光导。激发光通过宽场激发耦合接口进入显微镜中，进入二向色片和物镜中进行样品的激发。样品的荧光信号通过物镜采集及透过二向色片，通过发射带通滤光片选择所需的荧光波长，并使用CMOS相机进行成像。

BPAE细胞用三种不同颜色的荧光染料标记，以显示细胞内不同的细胞器。为了获得细胞的完整图像，使用不同的激发波长、二向色片和针对每种染料优化的带通滤光片获得了三张BPAE的独立图像。

Fig. 3 Widefield fluorescence image of bovine pulmonary artery endothelial (BPAE) cells. a) Green emitting filamentous F-actin, λex = 480nm with a 520±14 nm emission bandpass. b) Red emitting mitochondria, λex = 580nm with a 641±38 nm emission bandpass. c) Blue emitting nuclei, λex = 380nm with a 447±35 nm emission bandpass. d) Composite image of BPAE (combination of images a, b and c)

图3a - 3c分别为Alexa Fluor®488标记的丝状肌动蛋白、MitoTracker®Red CMXRos标记的线粒体和DAPI标记的细胞核的单独宽场荧光图像。然后将这些单独的图像进行组合，形成如图3d所示的复合图像，显示出完整的细胞结构。

FS5的氙灯和激发单色器提供了从200到1000 nm的可调谐的激发光源;与传统显微镜中基于滤光片的激发源波长选择相比，具有更大的波长选择及灵活性。激发单色器与液体光导耦合避免了白光灯源作为荧光显微镜光源时常见的缺点;如需要对灯源校正或者光源热量破坏样品。 

荧光光谱 

通过使用FS5将荧光重新定位至发射测液体光导中进行检测，测量BPAE细胞的荧光发射光谱。使用这种方法，在380 nm处激发BPAE细胞细胞核中的DNA结合的染料DAPI，获得如图4所示的荧光光谱。

Fig.4 Fluorescence spectrum of DNA-bonded DAPI. 

荧光寿命 

耦合荧光显微镜的FS5也可用于获取标记BPAE细胞的荧光寿命。对于荧光寿命测量，使用激光激发耦合器将脉冲二极管激光源安装在显微镜上，相机和显微镜样品台用于将激光束聚焦到样品中的特定关注的样品测试点。使用FS5的发射单色仪选择所需的发射波长，并使用TCSPC获取荧光衰减。利用EPL-375脉冲二极管激发细胞核内dna键合DAPI, TCSPC在460 nm处获得的荧光衰减如图5所示。寿命衰减曲线使用FS5的Fluoracle®操作软件进行拟合，显示平均寿命为1.85 ns。

Fig.5 Fluorescence decay of DNA-bonded DAPI acquired using TCSPC.

结论

使用FS5荧光光谱仪与显微镜耦合观察荧光标记的BPAE细胞。以FS5氙灯为连续激发源，获得细胞的宽场视野的荧光图像，揭示细胞的内部结构和特征。通过测量荧光标记的荧光光谱和寿命，进一步了解荧光标记的性质。本文突出了FS5在搭载显微附件时时的测量通用性及灵活性; 能够轻松获得图像，光谱和寿命信息。