- 2022-05-24 18:06:56 来源:Cytiva(思拓凡) 浏览量:202次
- 【导读】本期我们将分享层析填料常见问题及“秘籍”方法。
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作为层析纯化的先驱者,Cytiva拥有先进的包括实验室、中试和工业生产级别的层析系统以及丰富多样的层析介质填料,满足从研发到药物生产的需求。本期我们将分享层析填料常见问题及“秘籍”方法。
Q1
凝胶过滤预装柱堵了、超压如何处理?
可能原因:缓冲液或样品未进行过滤、蛋白沉淀或杂质残留、清洗不及时等引起层析柱滤膜堵塞;流速过快、流动相粘度 ( 如乙醇等 ) 过高、温度过低。
建议处理方法:首先将柱子卸下来,确定是系统还是柱子堵了。如果是柱子堵了:参考说明书CIP操作进行清洁;更换层析柱顶端滤膜或超声清洗 (HiPrep 与 Precision Columns 3.2/300 柱型不能拆卸换膜 ) ;必要时移除层析柱顶端 2-3mm 凝胶,调节 Adaptor 消除顶端死体积。部分预装柱,也可以将填料倒出,去除板结或碎填料后,重新装填。测定柱效或重复之前做过的样品。后续,注意样品前处理 ( 如核酸的去除、样品缓冲液条件 ) 以及层析柱的日常维护。
Q2
凝胶过滤层析有哪些应用的种类?
根据应用目的的不同,凝胶过滤层析主要可以分为以下三种方法:
制备级凝胶过滤纯化:对于分辨率有较高的要求:(1) 上样体积一般在柱体积的 0.5% – 4% ;(2) 运行较低的流速;(3) 使用较高的柱子 ( 一般 ≥60 cm)。经过纯化后的样品将被直接置换到合适的缓冲液条件中,用于后续的实验或储存。
分析型凝胶过滤层析:对于分辨率有很高的要求,上样体积一般在柱体积的 0.3% – 0.5% ,使用柱子的高度一般为 30cm。而在快速纯度检测和筛选实验中,常用的是 15cm 柱高的柱子,可以在提供足够的分辨率的前提下,缩短运行时间,节省样品和缓冲液。
脱盐与缓冲液置换:与上述的精细分离不同,脱盐或缓冲液置换属于组分分离,即将大分子样品与小分子或离子进行分离的过程,因此对于分辨率的要求相对不高。上样体积可达柱体积的 30%。
Q3
使用凝胶过滤进行样品的精细分离,应该如何选择层析柱?
根据目标蛋白的大小选择适合的分离范围。
根据上样量,选择合适的柱体积的柱子类型。上样体积一般在柱体积的 0.5%-4%。
根据具体需求确认柱子具体型号,一般选择高分辨率的柱子。
Q4
His 标签蛋白纯化实验中,常用的缓冲液成分是什么?
建议缓冲溶液成分如下 :
FF(高流速)、HP(高分辨率)系列:20 mM磷酸钠缓冲溶液,500 mM NaCl(避免非特异 电荷吸附),20-50 mM 咪唑(提高浓度,可以增加纯度但会降低收率),pH7.4 (可以根据实际情况调节pH)。
Talon 系列:20 mM 磷酸钠缓冲溶液,500 mM NaCl,10-20 mM 咪唑,pH7.4。
Excel 系列:20 mM 磷酸钠缓冲溶液,500 mM NaCl,pH7.4 (结合缓冲液中一般不添加咪唑,在wash缓冲液中可根据样品性质加入 0-30 mM 咪唑)。
洗脱缓冲溶液:20mM 磷酸钠缓冲溶液, 500 mM NaCl,500 mM 咪唑,pH 7.4。
Q5
针对未知样品,如何选择离子交换层析填料和操作条件?
自然界中绝大部分蛋白的 pI 在 5.8 或 9 附近,偏酸性更多。因此,针对未知样品,一般首先推荐强阴离子交换层析,如 Capto Q,使用中性缓冲液 pH 7-8。如果 Q 挂不上,可以再尝试强阳离子交换 Capto S 或 SP,选择 pH 5-6 范围。另外,可以选择样品流穿,杂质挂柱。HiTrap Capto IEX Selection Kit (货号 28934388),含 Capto S、Capto Q、Capto DEAE、Capto adhere 以及 Capto MMC 1mL 预装柱各一支,后两个为多模式填料,可用于填料筛选。
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- 标签:His 标签蛋白纯化实验 , 超声清洗 , 层析柱顶端滤膜
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