细胞分离液常见问题集锦

Percoll 和 Ficoll 细胞分离液是根据细胞密度的不同将细胞进行分离的一种密度梯度离心介质，具有生物友好，操作简单高效等优点。作为Cytiva的明星产品，Percoll 和 Ficoll 正在为广大用户提供优质的实验结果。今天，小编汇总整理了常见相关问题，希望在客户进行产品选择和使用时提供一些指导和帮助。

细胞分离液有哪些？他们之间有什么区别？

 1  细胞分离产品主要分 Percoll 和 Ficoll 两种，Percoll 的应用范围较广，不仅仅适于分离不同密度的细胞，还可分离亚细胞器和病毒，可实现从 1.0-1.3 g/ml 范围内的密度梯度离心分离。

 2  Percoll 分 Percoll 和 Percoll PLUS，Percoll 是 PVP 涂层硅胶介质，Percoll PLUS 是共价偶联烷硅涂层硅胶介质，性质更加稳定；Percoll PLUS 内毒素含量较低（<2EU/ml），有法规文件（RSF 文件）支持，可以用于临床研究，Percoll 仅能用于科研。

 3  Ficoll 是可以分离特定密度细胞的分离液（1.077, 1.084 和 1.073 g/mL 三款），适于已知密度细胞的分离。

Ficoll 和 Percoll 是无菌的吗？

 1  Percoll/Percoll PLUS 在生产过程中是经过高温灭菌处理的，但是由于瓶子的材质问题，只能在 113℃ 条件下进行，持续时间为 1 h。目前在官方说明书中不再申明 Percoll/Percoll PLUS 为无菌的。如果对灭菌要求较高，可以进一步灭菌，条件是 120℃，30 min，但需要从原包装瓶中转移出来。Percoll 溶液的高压灭菌必须在没有盐和蔗糖时进行（建议只对原液灭菌）。

 2  Ficoll 已经在 121℃、20 min 进行了灭菌，为无菌状态，建议无菌操作，分次取用即可。再次灭菌的话由于客户的灭菌设备等的差异，没有推荐的灭菌条件。另外如果灭菌时没有保证盖子的密封性和稳定的温度，可能会造成 pH 波动。

Percoll 的配制方法有哪些？

 Percoll 的配制一般有两种方法：

 1  按照百分比用两步法计算：用一份的 1.5M NaCl 或者 2.5M 蔗糖加九份 Percoll 原液，得到 100% 的 SIP 溶液。在此基础上，比如想要得到 44% 和 67% 的工作液，分别按 0.15M 的 NaCl 或者 0.25M 的蔗糖：SIP=（100-44）：44 和（100-67）：67 的比例取相应体积的溶液进行配制即可。

 2  根据密度进行一步法计算，该计算方法需要知道最 终配制的溶液的密度、细胞分离液的密度（Percoll 密度范围 1.130.005 g/ml，具体密度可根据批次号在英文官网中查询 COA 获得），以及用于稀释的 buffer 的密度（1.5M 的 NaCl 密度为 1.058 g/ml，2.5M 的蔗糖的浓度为 1.316 g/ml），推荐官网的计算小程序。

Ficoll 分离人外周血单个核细胞 (PBMC) 的原理是什么？具体实验操作时常见问题及原因分别如何？

 根据细胞密度的不同进行分离。单个核细胞的体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为 1.092 左右，淋巴细胞和单个核细胞比重为 1.075 左右。利用 Ficoll 作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集：血浆和血小板密度较低,，悬浮于分离液的上部；红细胞与粒细胞密度较大，沉于分离液的底部；PBMC 密度稍低于分离液，位于分离液界面之上，移去上层组分就可获得 PBMC。

常见问题及可能的原因如下：

 1  Ficoll Paque PLUS 分离人外周血中的 PBMC，血小板污染比较多，如何改善？

可以从如下方面降低血小板的污染：

（1）在较低的离心力情况下（比如 200 g）进行离心处理，血小板密度比较低，会留在血浆中，PBMC 在沉淀里。通过这一操作可以除掉一部分血小板。

（2）增加分离后的洗涤步骤；

（3）不管用哪种离心管，保持样品的高度/ficoll 的高度比为 3/2.4，这一点需要严格遵守。  

（4）取目的层样品时，需要先将上层溶液去掉，再吸取目的层。

（5）注意离心温度在 18-20℃，另外考虑血液样品本身是否是正常的血样。

 2  Ficoll-Paque PLUS 分离人外周血中的淋巴细胞，为何出现红细胞等污染？

（1）可能由于温度太低。在低温下，Ficoll-Paque PLUS 的密度较大，红细胞凝集较少，因此粒细胞和红细胞被阻止进入 Ficoll-Paque PLUS 层。应将温度增加到 18-20 °C；

（2）可能离心速度太慢和/或离心时间太短。必须采用适当的时间和离心力，以确保非淋巴细胞完全沉淀。

 3  Ficoll-Paque PLUS 分离人外周血中的淋巴细胞，为何淋巴细胞低产量且低活力 ？

可能是由于温度太高造成。在高温下，Ficoll-Paque PLUS 的密度较小，一些淋巴细胞可能穿透 Ficoll-Paque PLUS 层。因此，细胞活力也必然会受到影响。应将温度降低到 18-20 °C。

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