尼高力红外通讯 第3期 丨PharmTech采访之 傅里叶变换红外/近红外/拉曼光谱用于生物制药分析

背景

自2020年新冠疫情的持续蔓延与新冠疫苗接种，生物制药行业在近两年实现了巨大发展。全 球有128家专注于治 疗性产品的生物制药公司在全 球接连上市。其中，傅里叶变换红外/近红外/拉曼光谱技术在药物研发与制药安全过程中有着重要的作用。赛默飞作为傅里叶变换红外/近红外/拉曼光谱技术的领 导者接受了PharmTech的系列采访。下面是相关的采访过程与实用案例分享。

系列采访1

蛋白质二级结构

采访对象：

Suja Sukumaran博士

赛默飞高级应用科学家

采访摘要：

PharmTech采访了Suja Sukumaran，讨论了傅里叶变换红外(FTIR)分析蛋白质的优势，为什么二级结构是重要的，未来的趋势，等等。

FTIR对于蛋白质有哪些应用?

红外光谱已被证明是研究生物分子的一个非常强大的工具。一般来说，它被用来表征蛋白质、脂质、糖、纤维素和其他生物化学物质。特别是对于蛋白质，FTIR用于二级结构测定、结构-功能相关性、蛋白质稳定性以及蛋白质折叠和去折叠。傅里叶变换红外技术在制药和生物技术行业的应用很普遍，在食品行业的应用也越来越多。

如何从光谱中计算二级结构，为什么它很重要?

在测定蛋白质的二级结构时，红外光谱比其他方法(如x射线衍射、核磁共振(NMR)或反射电子显微镜(REM))具有独特的优势，因为它可以自己深入到二级结构中，而且速度非常快。当研究二级结构时，仪器观察的特征区域是酰胺区域或酰胺键。蛋白质的二级结构由α、β和随机结构组成。

一般情况下，如果需要确定蛋白质的二级结构，研究人员会分析400 ~ 4000cm-1。他们关注的关键区域是酰胺I区，在1600 ~ 1700cm-1之间。虽然其他区域如酰胺II区和酰胺III区也被用于分析，但是酰胺I区是二级结构分析的关键区域。在光谱被采集后，宽峰会被去卷积为独立的分量，然后使用软件中的峰拟合函数将其拟合到原始的峰上。在拟合了峰值后，就可以得到峰面积，该面积用于计算α螺旋、β折叠和随机结构的百分比。所有这些都可以通过标准的OMNIC软件实现。也可以利用其他一些商业软件对我们的数据进行类似的二级结构评估。

使用FTIR分析蛋白质的优点是什么?

使用FTIR是快速、无损的，仅需要极少的样品准备。仪器结构紧凑、不需占用太多空间，且不需要任何消耗品。在大多数情况下，宝贵的纯化蛋白质材料可以回收。除了纯蛋白质分析外，FTIR还可以观察蛋白质混合物或含有添加剂和抑 制剂的蛋白质混合物，然后对其稳定性、动力学等进行表征。蛋白质也可被用于各种形态：粉末、液体、凝胶、水凝胶或沉积在表面上。

另一个优点是，从FTIR中获得的光谱可以在几分钟内生成，并且简单、易于理解。随着软件和计算技术的进步，这些分析已经变得相当常规和快速。

我们还能从分析中得到什么信息?

蛋白质的红外光谱不仅可以了解蛋白质的二级结构，而且还可以列举氨基酸的细节。例如，可以通过观察蛋白质的侧链质子化和去质子化状态来了解结构和功能。

还可以分析大多数蛋白质以及不同环境下的肽样品(即不同的缓冲条件，温度条件和pH条件)。所有这些都有助于更好地理解蛋白质的稳定性。

在蛋白质分析中使用哪些FTIR主机和附件，如何使用?

根据最 终目的，对蛋白 粉、蛋白溶液、冻干蛋白等进行QA/QC测试时，可使用我们的分析型FTIR：Nicolet™ iS5和Nicolet™ Summit。如果需要更高的检测极限，高端FTIR(如iS50)可以提供最 高的灵敏度和最 好的信噪比。Nicolet™ iS50R用于步进扫描测量和各种快速动力学测量。有一系列的从分析型到研究型FTIR可用于红外光谱分析。

附件的选择也取决于最 终目的或样品形态的类型。例如，如果从纯粉末、冻干材料或浓缩溶液开始，可以使用单次或多次衰减全反射(ATR)附件测量。单次ATR适用于高浓度和纯物质；多次ATR用于低浓度的材料。

蛋白质也在透射模式下进行分析，大多数研究使用一个短光程的透射池，光程范围大约在6到10微米。此外，人们对蛋白质和多肽涂层的分析也越来越受到人们的关注。这些涂层要么在玻片上，要么在硅片上，要么在聚合物表面上。这些样品可以用掠角镜反射或掠角ATR附件进行分析。还有研究人员想要表征特定材料表面蛋白质和多肽的取向。这时，我们可以通过红外偏振进行分析。

实用案例分享

采用OMNIC软件分峰拟合功能对酰胺I带进行分析，结合各二级结构对应的吸收位置（如上图），蛋白质二级结构的计算结果分别如下，图中红色曲线为原始谱图，蓝色曲线为拟合之后的结果，黄色曲线为原始谱图二阶导数结果，绿色谱图为各拟合峰位。

1、样品pH2.0

各二级结构拟合结果如下所示：

2、样品pH2.5

各二级结构拟合结果如下所示：

3、样品pH3.0

各二级结构拟合结果如下所示：

4、样品pH3.5

各二级结构拟合结果如下所示：

5、样品pH4.0

各二级结构拟合结果如下所示：

6、样品pH4.8

各二级结构拟合结果如下所示：

总结：

采用Nicolet高灵敏度ATR附件，可快速无损获得高质量的蛋白质样品谱图，结合Nicolet OMNIC软件的强大功能，能够实现对蛋白质二级结构的快速分析，获得各结构对应的峰面积值，可获得各条件下蛋白质二级结构的相关信息机变化情况，可以为蛋白质类样品的快速质控提供有力手段，结合其他参考分析数据，可实现对各二级结构的快速定量。