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空间代谢组学揭示不同蒸煮时间点生、加工附子化学成分的动态变化

2022-06-11 11:21:13  来源:沃特世科技(上海)有限公司(Waters) 浏览量:149次
【导读】根据DESI-MSI获得的m/z和强度进行PCA和PLS-DA分析,以区分附子在不同蒸煮时间点的变化。

附子是著名的有毒传统草药,由于其非凡的药理活性和高毒性,长期以来在中国和亚洲许多国家被用于治 疗各种疾病。降低附子毒性的不同炮制方法对其临床安全使用具有重要意义。


近期成都中医药大学民族医药学院刘悦唐策老师在Frontiers in Pharmacology发表了一篇题为《Unveiling Dynamic Changes of Chemical Constituents in Raw and Processed Fuzi With Different Steaming Time Points Using Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Imaging Combined With Metabolomics》(doi: 10.3389/fphar.2022.842890)的研究论文,采用解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)与代谢组学相结合的多元统计分析方法(图1),对一系列乌头生物碱进行研究,并探索潜在的代谢标志物,以了解不同蒸煮时间点的生附子与加工附子之间的差异,为无胆附片的开发提供了数据支撑。


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图1. 基于DESI-MSI和代谢组学对无胆炮制附子成分研究流程。


实验方法01
样品制备

将清洗干净的生附子随机分成11组,其中一组作为生附子(不蒸),其余的放入合适的容器中蒸1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和 10.0 小时。所有样品均直接切片, 随后,使用双面胶带将样品粘在载玻片上进行DESI-MSI分析。


DESI实验条件

采用配备有DESI源的Waters Xevo G2-XS QTof质谱仪进行成像实验。

  • DESI参数:雾化气体(氮气)压力:0.45 MPa;

  • 喷雾溶剂:70% MeOH、30% H2O(含0.2 %甲酸和0.1 mM亮氨酸脑啡肽),流速为 2 μL/min;

  • 毛细管电压:4.5 kV;

  • 电离方式:正离子模式,扫描质量范围m/z100–1,000,像素大小为 200 μm,扫描速率400 μm/s 。


实验结果02
溶剂条件优化

利用标准品点板对DESI喷雾溶剂进行优化,考察了不同水甲醇比例、甲酸浓度(图2),根据附子样品中主要酯类生物碱的信号强度稳定性,确定喷雾溶剂条件为70%甲醇 — 30%水(含0.2%甲酸)。


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图2. DESI-MSI喷雾溶剂考察。


蒸制对附子毒性及活性成分的影响

为了评估蒸制对附子毒性及活性成分的影响,采集0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h蒸制时间点的样品、切片分别采用DESI-MSIHPLC对其进行分析。发现在蒸制3 h及以后的所有样品,双酯型单酯型生物碱的含量均符合药典要求。


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图2.不同时间点附子中六种酯类生物碱的DESI质谱成像图和相应HPLC色谱图。


利用统计分析获得附子最 佳蒸煮时间

根据DESI-MSI获得的m/z和强度进行PCAPLS-DA分析,以区分附子在不同蒸煮时间点的变化。PCA得分图显示所有成分可分为三大类(图3A)。结合HPLCDESI-MSI多变量统计分析的结果,4h被证明是附子减毒保效的适宜蒸煮时间。


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图3. 不同时间点蒸的生和加工附子的PCA (A) 和 PLS-DA (B)得分图。


不同蒸制时间的生、加工附子鉴定的代谢标志物

根据HPLCDESI-MSIPCAPLS-DA的结果,选择0h、4h、8h作为关键蒸制时间点,以揭示代谢标志物,应用OPLS-DA分别比较0和4h、4h和8h样品间的代谢变化,共鉴定出42个差异代谢物(图4),所有42个差异组分均通过DESI成像进行可视化(图5)。生、加工附子蒸煮不同时间点代谢标志物的热图反映出不同时间点附子中42个代谢物的变化情况(图6),发现一些代谢物在蒸制前3h时不稳定,随后区趋于平衡;蒸制10h后,代谢物与4-5h的样品相似。此类现象与PCAPLS-DA结果相吻合。


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图4. 基于DESI-MSI数据的附子0 h和蒸 4 h (A,B) 及蒸4和8 h(C,D)的OPLS-DA得分图和S-Plot图。


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图5. 生和蒸煮 4和 8 h附子的中 42种代谢标志物的DESI成像图。


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图6. 生、加工附子蒸煮不同时间点代谢标志物的热图。


0小结

DESI-MSI以其样品前处理简单、相对无损等特点在天然产物(初级和次级代谢物)测定中的广泛应用证明了其强大的功能和良好的实用性。DESI-MSI代谢组学技术相结合的方法,为传统组学研究增添了另一空间维度的可靠信息,同时为更深入的研究工作提供了全新工具。



标签:代谢组学技术 , DESI-MSI , DESI成像图
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