基于EAD碎裂的生物制品关键质量属性的MAM策略

Multi-Attribute Method(MAM)是基于质谱的一种自动化分析方法，可以实现在生物制品研发和生产过程中，用质谱方法一次进样同时监测多个产品质量属性（PQA），从而将质谱这一传统意义上用于研发的分析技术，应用于产品放行。如何可信地表征生物制品的关键质量属性（PQA）一直是生物制药企业MAM技术的核心问题。基于碰撞诱导解离（CID）的MAM工作流程通常需要结合互补的MS/MS技术用于鉴定氨基酸同分异构体等PQA。传统的ExD碎裂受限于过长的循环时间和低灵敏度，无法在单针进样的情况下实现相关PQA的MAM分析流程，而基于全新电子活化解离（EAD）的MAM技术，单针进样即可准确，快速，灵敏且可重现地分析生物制品的PQA，如氨基酸同分异构体等。

多质量属性监测MAM：

MAM是一种功能强大的LC-MS方法，用于同时监测和量化生物制品的多个产品质量属性（PQA）或关键质量属性（CQA）。传统意义上，基于CID的MS/MS被用作鉴定的第 一步，然后使用基于MS或MS和MS/MS工作流进行量化。然而，基于CID的MS/MS方法不可能对发生脱酰胺化的肽段进行全序列确认，包括区分亮氨酸与异亮氨酸、天冬氨酸与异天冬氨酸（Asp vs. isoAsp）以及脆弱修饰（如糖基化）的定位。因此，基于CID的鉴定工作流程必须依赖于互补的MS/MS技术，在对所选物种进行量化之前，在单独的实验中使用其他更先进的仪器。我们可以使用基于EAD的平台方法5,6解决这一挑战，该方法能够在单针进样中使用MAM对PQA进行可靠、准确的识别、量化和监测（图1）。

图1：基于EAD的MAM工作流程。ZenoTOF 7600系统提供的EAD平台方法1-4为序列确认和翻译后修饰（PTM）的识别提供了可靠的肽图结果，并能够区氨基酸分异构体。这是MAM获得这些PQA和CQA准确量化结果的先决条件。用于肽图分析的Biologics Explorer软件和用于PQA和CQA量化的符合合规要求的SCIEX OS软件的结合，使基于EAD的MAM工作流成为一个简化的单针进样过程。

基于EAD的MAM工作流的主要特点：

1

可靠的PQA识别和氨基酸异构体区分：单针进样的EAD平台方法可以区分氨基酸异构体和翻译后修饰（PTM），这对传统表征和MAM方法具有挑战性。

2

简化的数据流：可定制的PQA列表将Biologics Explorer软件中的肽图结果与符合合规性要求的SCIEX OS软件将PQA量化和监测关联起来。

3

强大的肽图软件：Biologics Explorer软件为肽图分析和PQA选择提供了强大的算法和优化的工作流。

4

合规性：PQA量化和监控。

MAM流程概述：

图2：Biologics Explorer软件结合合规软件SCIEX OS的MAM工作流。在此流程中，使用Biologics Explorer软件从EAD DDA数据的肽图中非常可信地确定了mAb的PQA。选择感兴趣的PQA并将其导出到.txt文件，然后导入到使用SCIEX OS软件的分析模块创建的处理方法中。峰面积积分使用MQ4算法执行，然后创建用于相对PQA量化和监测的自定义模板。报告功能提供了许多用于自定义和选择不同文件格式的选项，例如word文档和pdf文档。

PQA的监控：

分析模块提供了充分的灵活性，可以在处理方法中构建自定义公式，用于计算PQA的丰度百分比7-8。图3显示了VVSV肽段PQA的量化结果，该结果是通过将带有自定义公式的处理方法应用于NISTmAb对照品的3次重复进样，并持续给予加热压力而获得。考虑到定量结果的严格性，计算的百分比丰度在CID和EAD方法中均具有高度的重现性（%CV<10%）。

图3：SCIEX OS软件的分析模块对PQA的相对定量结果，图标列出了以NISTmAb为对照，热压情况下三次进样VVSV肽段的异构化和脱酰胺化峰面积的丰度百分比。

从0天到10天持续给与加热压力，脱酰胺化程度Asp和不同isoAsp形式的百分比值显著增加。为了快速检查结果，SCIEX OS软件提供了用于可视化的度量图（图4A），或者可以使用其他绘图选项在Excel中导出和处理结果（图4B）。

图4：MAM的可视化结果。图（A）和图（B）都展示了重复进样的PQA量化的重现性，以及MAM工作流监测PQA丰度百分比的能力，以用于不同时间节点研究。

总结：

1.PQA的可靠识别及氨基酸异构体的明确区分对于MAM的成功实施至关重要。

2.通过基于EAD碎裂的DDA采集方法，可以区分脱酰胺作用中的Asp和isoAsp异构体，脱酰胺化是PQA的一个重要类别，可能影响药物的疗 效和安全性。

3.通过现成的工作流程模板，Biologics Explorer软件实现了高效识别，该模板提供了可靠的肽图结果和可视化工具，能够将PQA列表导出到SCIEX OS软件进行量化。

4.符合法规要求的SCIEX OS软件为PQA的峰提取和相对定量提供了强大的算法和工具。

5.通过Biologics Explorer软件和合规的SCIEX OS软件之间的数据流，实现了从识别到量化的有效MAM工作流。

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References

1. Takashi Baba, Pavel Ryumin, Eva Duchoslav et al. (2021) Dissociation of biomolecules by an intense low-energy electron beam in a high sensitivity time-of-flight mass spectrometer. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 32(8):1964-1975.

2. Comprehensive peptide mapping of biopharmaceuticals utilizing electron activated dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12639-B.

3. A new electron activated dissociation (EAD) approach for comprehensive glycopeptide analysis of therapeutic proteins. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12980-A.

4. An evaluation of single injection platform method for advanced characterization of protein therapeutics using electron activation dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-13965-A.

5. Differentiation of aspartic and isoaspartic acid using electron activated dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12550-B.

6. Differentiation of leucine and isoleucine using electron activated dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12605-B.

7. Compliant attribute monitoring for biopharmaceutical product quality attributes employing intact mass analysis. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-11314-A.

8. A liability study on oxidation using SCIEX OS software 1.7 for intact MAM. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-11551-A.

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