- 2022-07-06 18:08:58 来源:徕卡显微系统(上海)贸易有限公司 浏览量:198次
- 【导读】荧光显微镜是生命科学的重要研究工具之一,用于观察细胞结构和功能。荧光显微镜的一个关键优势在于能够识别多个目标,并能够观察他们之间的相互作用。
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什么是TauInteraction?
荧光显微镜是生命科学的重要研究工具之一,用于观察细胞结构和功能。荧光显微镜的一个关键优势在于能够识别多个目标,并能够观察他们之间的相互作用。
分子相互作用为细胞提供能量,将基因组信息转化为细胞的各种结构(Jacob F,Monod J.1961)。广义地讲,至少有三种类型的分子相互作用:核酸(DNA/RNA)-蛋白质、蛋白质-蛋白质和小分子-蛋白质(Zhang W et al. 2002, Schlessinger K et al. 2009, Yan L and Lamb RF 2011, Dunn JA et al. 2015, Pires BRB et al. 2018, Vidya MK et al. 2018)。
通过共振能量转移(FRET,Förster 1960)实验可以确认两个分子之间发生相互作用。为了进行FRET实验,被研究的分子中的一个被标记了充当“供体”的荧光探针,而另一个分子被标记了充当“受体”的探针。这样的“供体-受体对”中供体的发射光谱和受体的激发光谱基本重叠。在这些条件下,如果两个荧光团彼此足够接近(小于10 nm,Valeur 2001)并且方向合适(Pietraszewska-Bogieland Gadella 2011)时,则可能发生FRET。距离和分子方向将决定发生了多少FRET,我们用FRET效率来衡量它,也是量化分子相互作用的最 广泛的方法(Valeur 2001)。报告FRET发生状态的另一个值是相互作用供体(fD,fraction of interacting donor)的比例,它对应于在设定的时间内有多少分子参与分子相互作用(Valeur 2001)。
本质上,来自供体荧光团激发态的能量通过以非辐射方式(不发射光子)转移到受体荧光团。这一过程导致
供体的荧光强度降低;
受体的荧光强度增加;
供体的荧光寿命缩短(Jares-Erijman and Jovin 2006)。
这些来自于供体和受体不同的信息是获取和分析FRET数据的一些策略的基础。许多FRET方法依赖于基于强度的测量,例如供体猝灭、受体光漂白和敏化发射(Berney and Danuser 2003, Padilla-Parra and Tramier 2012, Algar WR et al. 2019)。基于强度的FRET简化了仪器要求,但增加了实验设计产生假象的风险(例如,供体-受体相对信号不平衡、通道间串色、供体光漂白、光致变性)或不太适合活细胞长时间观察 (比如强光对样品带来的光毒性)。
为什么要使用TauInteraction?
FLIM(荧光寿命成像)-FRET方法仍然是FRET实验的金标准,因为FRET读数只取决于供体荧光寿命的变化,从而绕过了基于强度的方法面临的大多数风险(Padilla-Parra and Tramier 2012, Algar WR et al. 2019)。然而,FLIM实验的复杂性使得这种基于FLIM的FRET分析方法长期局限在擅长生物物理的一些科学家群体中被使用。
在基于荧光寿命的方法中,人们一直在努力寻找不需要复杂的物理模型,更直接的方法来探索FRET效率。这些无需拟合的方法主要侧重于提供相关数据,以便更好地理解正在研究的生物系统(Leray et al. 2013)。遵循这一理念的供体分子的最 小比例(mfD,minimal fraction of donor molecules)是一个简单但很有用的概念(Padilla-Parra S et al. 2008, 2011 and Leray et al. 2013)。mfD的目的是评估参与FRET的最 小分子数量。mfD与相互作用供体的比例有关(fD,Padilla-Parra S et al. 2008)。为此,mfD使用在没有受体的情况下来自供体分子的荧光寿命值参与计算(图一 A)。根据这一点,它根据测量到的荧光寿命变化计算出必须与该供体相互作用的最 小分子数量。通过这种方法,mfD特别适合于基于相互作用蛋白质的最 小相对浓度实时地读出分子间相互作用发生的程度。
图一:TauInteraction原理图. A) mfD公式。详情请见Padilla-Parra S et al. Biophys J. 2008. B) 图示供体 (D, 绿色圆形) 和受体 (A, 红色三角)。TauInteraction可以基于mfD值描述相互作用的分子的百分比。
该如何使用TauSense来量化FRET
mfD概念非常适合于STELLARIS平台,因为STELLARIS的TauSense工具可以直接获取基于荧光寿命的信息(图一及其参考文献)。为了利用荧光寿命来定量读出FRET状态,我们实现了mfD作为一个新的TauSense工具,称为TauInteraction。TauInteraction的工作原理如下(图一):在FRET实验中,可能有许多分子(供体和受体)非常接近,如果这些是随机事件,发生FRET的平均分子数量可以忽略不计。相反,如果分子之间存在活跃的相互作用,它们保持紧密接近的时候将引起供体荧光寿命的降低。如果发生这种情况,TauInteraction会报告导致这种变化的分子比例。实验结果是一张TauInteraction图,其中包含在逐个像素级别上相互作用的分子的比例,图片将实时(即在图像采集期间)展现。此外,还提供了供体的荧光强度,如果需要,可以使用基于强度的FRET工具进行独立分析。
作为TauInteraction如何将分子相互作用转化为定量读数的一个例子,我们首先用串联结构来评估其表现,表达带有短氨基酸序列的蛋白质的供体-受体荧光蛋白对(EGFP-mCherry)( Tramier M et al. 2006)。这种结构在瞬时转染的活细胞中显示出恒定的正FRET行为(见图二)。有27%到29%的分子发生了互作。这与生物样本中最 大可观察到的FRET是一致的(Padilla-Parra S et al. 2009)。如果我们有分离的供体和受体分子,相互作用的比例将低于这个最 大值。如果我们降低受体分子的数量,我们就可以模拟这种情况。这很容易通过光漂白一些mCherry信号来实现。在光漂白一些受体并消除相互作用后,我们观察到样品中相互作用的分子的总比例下降了约50%(图二)。
在STELLARIS上集成了基于荧光寿命的工具TauSense,比如TauInteraction,为研究人员以稳定和可量化的方式研究FRET过程铺平了道路,最 终目标是获得生物相互作用的功能性数据。
图二:活细胞中的TauInteraction。A)来自EGFP-mCherry串联的强度图像。B)在细胞上设置了三个感兴趣区(ROI),并在ROI1中使用高光强来漂白受体分子。图中显示了EGFP和mCherry的强度。TauInteraction图像显示了细胞中存在的相互作用分子的比例(以%值表示),漂白区域的百分比明显较低,这与受体分子的损失一致。
参考文献:
1. Dunn JD, Alvarez LAJ, Zhang X, Soldati T. Reactive oxygen species and mitochondria: A nexus of cellular homeostasis. Redox Biol. 2015. PMID: 26432659 Free PMC article. Review.
2. Förster, T. Transfer Mechanisms of Electronic Excitation Energy. (1960). Radiation Research Supplement 2.
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4. Jares-Erijman EA, Jovin TM. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr Opin Chem Biol. 2006 Oct;10(5):409-16. doi: 10.1016/j.cbpa.2006.08.021. Epub 2006 Sep 1. PMID: 16949332 Review.
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主题
利用简化FRET-FLIM方法直观研究蛋白质相互作用
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直播时间
北京时间2022年7月19日,22点
3
讲者信息
Dr. Sergi Padilla-Parra, Senior Lecturer, Randall Centre for Cell & Molecular Biophysics, King's College London
Dr. Julia Roberti, Product Manager, Leica Microsystems
- 标签:荧光显微镜 , 共振能量转移
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TauInteraction | TauSense新成员,研究分子间相互作用
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