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Q&A | AUC分析超速离心技术应用交流会

2022-10-02 11:04:51  来源:贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司 浏览量:464次
【导读】本届AUC应用交流会围绕病毒载体表征及蛋白质研究等热门应用话题,重 点关注结构生物学及基因治 疗行业的发展及技术趋势。

9月8日的贝克曼库尔特生命科学AUC分析超速离心技术应用交流会已圆满落幕。本届AUC应用交流会围绕病毒载体表征及蛋白质研究等热门应用话题,重 点关注结构生物学及基因治 疗行业的发展及技术趋势。会上我们有幸邀请到来自清华大学、厦门大学、派真生物、九天生物等科研及工业领域的专家共同分享AUC应用及技术经验。会中收到了大家的踊跃提问,我们精选了一些问题与答案,希望能够帮助您不断了解AUC技术趋势并开拓各种新的重要应用,加速新的科学发现。



请问SE和SV两种模式怎么选择?


首 选SV,速度快,SV是目前最常用的实验方法,对于自聚集KD值相关研究建议选择SE。


测定Kd值最 好是用SE吗?


自聚集KD值研究首 选SE。


请问测二聚体蛋白自身KD需要怎么做呢?


可参考李文奇老师近期文章:《沉降速率法研究蛋白质自聚集》。


2.AUC数据分析相关内容:


请问AUC检测相同的抗体样品,复孔之间有差异,原因可能是什么?


注意操作细节及cell alignment。可参考最近发表的一篇文章:Best Practices for Aggregate Quantitation of Antibody Therapeutics by Sedimentation Velocity Analytical Ultracentrifugation。


请问 AUC用于AAV样品实心率检测的精密度怎么样?同一样品不同时间检测?


RSD 5%以内。


f/f0的意义?


蛋白质在溶液中的摩擦系数为f,而对于理想的非水化的刚性球体的摩擦系数为f0。摩擦系数和轴长比是相关的,根据f/f0比值,可以推算蛋白的形状是什么样的,若f/f0接近于1的样品,表明其形状接近圆球形;如蛋白分子为线性结构,则f/f0比值会远大于1,如胶原蛋白f/f0比值大于 2。


3、AUC实验细节:


如何确定AAV检测合适的转速?


AUC的转速高低会对表征精度产生影响,需要在AUC分离精度和数据采集二者进行权衡,即既能达到理想的分离精度,又能采集足够的数据。通常建议在研发的早期使用较高的转速进行实验,研究包括empty、partial、full及aggregate等各个组分情况,后续工艺稳定后,可根据实际情况选择较低一点的转速。


请问贵公司AAV吸收波长定为A230,有什么依据吗?


使用230nm进行AAV空壳率检测,无需后续的矫正。而使用260nm和280nm则需要进行矫正。详见下述参考文献的附件内容:Comprehensive Size Distribution and Composition Analysis of Adeno-Associated Virus Vector by Multiwavelength Sedimentation Velocity Analytical Ultracentrifugation。


想问一个数据处理的问题。f/f0是检测之后,软件拟合出来的结果,还是在拟合前参数设置时输入的数值?为什么参数设置时输入了一个f/f0的数值,勾选后,拟合结果显示的f/f0数值与设置的数值不一样呢?但设置了f/f0数值,不勾选时,拟合后的f/f0结果和设置时就是一样的。那么在处理数据时该不该勾选呢?


使用sedfit软件进行数据处理的时候有两种模式,run模式和fit模式,fit模式更精确,耗时更长。如果在fit模式下勾选了f/f0,软件会自己拟合一个合适的数值,所以fit后f/f0会变为软件拟合的数值。如果没有勾选,软件按照你所输入的数值进行拟合,拟合后输出的结果就是你输入的数值。


buffer吸收太高的话,可以用水替代吗?


不可以,建议换液。


请问部分AAV峰有多个且和实心AAV峰没有明显的区分,这种情况下是否有办法对某一个峰进行鉴别?


自聚集KD值研究首 选SE。



4.AUC应用问题:


AUC可以区分细胞膜蛋白的聚集状态吗?单体、二聚体、四聚体或者寡聚状态?这其中需要注意什么?


AUC可以区分膜蛋白聚集体的状态,SV的方法可以进行有效区分,需要注意去垢剂的量,其对膜蛋白聚集状态有一定影响。如果要得到准确的数值需要使用SE法。


请问AUC可以分析囊泡型中性脂质体佐剂或水包油乳剂佐剂与抗原的相互作用么?


可以进行尝试。


DCE-AUC是一种分析方法了吗?CsCl没有光谱吸收吗?需要的样品量是多少?


是的。CsCl在260,280及230nm处没有光吸收。所需的样品量仅为8×e10  vp/mL(若滴度8×e12  vp/mL AAV样品在230nm处吸收值为1OD)。


DGE-AUC,还可以用在哪些领域?


AAV,腺病毒以及其他的溶瘤病毒等众多领域。


5.AUC与其他正交方法:


AUC与SEC在分析蛋白药物聚体中哪一个更受法规青睐呢?是否需要两个都做?做正交验证?


二者皆为FDA推荐的方法,AUC的分析精度更高,更接近天然状态。建议有条件二者都做,特别是要进行中美双报。


AUC、SEC-MALS、mass photometry检测空壳率哪一个更好?


目前AUC是大家最公认的检测方式。后两种方法同样有各种的优点及缺点。


以上就是AUC应用交流会常见问题Q&A,希望对大家有所帮忙。

在未来,我们相信AUC技术将在各种学科领域有着不可限量的发展空间。


标签:AUC分析超速离心技术 , AUC分析超速离心技术应用交流会
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