利刃出鞘：Echo助力NGS发展新趋势

在过去十多年里，随着二代测序技术的发展，测序成本已经下降了几个数量级，但是二代测序样品文库制备成本仍然高昂，文库制备流程复杂且繁琐，这就要求实验人员投入大量的时间且精力。然而，在测序需求日益增加的同时，人工进行文库制备显然无法满足高通量、高质量、低成本的需求。越来越多的人选择使用自动化移液工作站进行文库制备，来实现高通量、高质量、低人工成本的的目标。

传统的二代文库构建，包含样本片段化、末端修复、加接头、纯化、PCR扩增、纯化等步骤，步骤繁琐且耗费时间。传统的自动化移液工作站一般以一个96孔板为单位进行文库制备，液体处理专家贝克曼库尔特创新推出Biomek i5+Echo 525超高通量自动化整合系统（以下简称“整合系统”），能够实现超高通量、微量化、超快速文库制备。

图1. Biomek i5 +Echo 525整合系统。通过将Echo 525快速、精确的声波移液技术与Biomek i系列工作站强大而灵活的功能相结合，可以将文库制备工作提高到超高通量。

图2. Biomek 工作站 + Echo声波移液系统文库构建工作流程

以常见的Nextera XT DNA Prep Kit为例，使用整合系统进行文库制备时，所有微量化反应均在Echo 525上进行，源板制备、磁珠纯化、热循环孵育和振荡等步骤，则在具有选择性吸头移液功能的Biomek i5 MC 384中进行。文库的定量由Biomek i5 MC 384+Echo 525整合系统完成。随后的文库均一化和pooling，在Echo 525上直接进行：仅需7分钟即可完成，且无需吸头。Biomek i5的360度全方位旋转机械手可自由进出Echo 525，无需整合其他装置。

图3. 微量化Illumina Nextera XT文库制备的自动化流程。灰色代表Biomek i5完成步骤，蓝色代表Echo 525完成步骤，红色代表手工干预步骤。Echo用于反应体系构建及Normalization/pooling；Biomek配置384通道加样器，并具有选择性吸头移液功能，用于分装Echo所需试剂并进行产物纯化；可选配台面整合的PCR仪，用于PCR扩增和孵育，减少人为干预。

整合系统进行文库构建的优势

多

整合系统能够实现超高通量，单次384例样品的文库制备

快

4小时左右，手工能完成8例样品的文库制备（根据试剂盒protocol），传统的Biomek i7自动化工作站能够完成96例样品的文库制备，整合系统能够完成384例样品的文库制备。

好

在Agilent TapeStation 2200系统上使用High Sensitivity D5000胶条随机选择15个文库检测，文库制备的最 终文库片段大小介于500 – 1500 bp之间（图4A）。Quant-IT Pico assay分析生成的标准曲线R2 值为0.999（图4B）。

图4A：在装载High Sensitivity DNA 5000胶条的TapeStation 2200系统上分析菌株DNA，建库起始量约20ng

图4B：Quant-IT Pico assay分析标准曲线和计算方式

对文库进行pooling测序，结果显示，Q30为92.93%（图 5A），PF显示所有样品的索引比对率相等，均在预期百分比内（图5B）。总体而言，每个循环的read质量值均表明该质量值与传统的2x150基因组测序结果相似。

图5A：Nextera XT DNA MiSeq测序质量值分布

图5B：Nextera XT每个索引的reads识别率

省

降低样品投入量，降低试剂消耗量。

在整合系统上，可将Nextera XT DNAPrep kit试剂用量缩小20倍，可从DNA中制备多达384个双末端标签文库，并用于后续Illumina平台测序。文库制备仅需50 pg起始样本。

Better together—— Echo + Biomek

自动化NGS建库方案

• 微量化建库，缩减反应体积，降低试剂成本

• 声波移液，降低耗材成本，减少交叉污染

• 缩短建库时间，提升单位时间内建库通量

• 标准化工作流改善实验结果