铁皮石斛和金线莲中3种植物生长调节剂的测定

植物生长调节剂(PGRs)对植物生长、发育及衰老等方面起着重要的作用,通过人工添加PGRs,可以增加植物次生代谢物的累积量,改善品质、增加有效成分含量。因此,越来越多的PGRs应用于中药材尤其是铁皮石斛和金线莲这些名贵药材的人工栽培过程中。据文献报道,在铁皮石斛和金线莲药材栽培过程中通常会在基础培养基中加入吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)或者吲哚丁酸(IBA)。然而使用过量的PGRs不仅会影响药材的品质和疗效,而且会引发一系列的安全性问题,因此,为避免过量残留的PGRs对人体造成健康隐患,建立精确测定残留量的技术方法,完善中药材中PGRs残留量的限量标准是非常重要的。

目前,应用于中药材中PGRs残留量检测的前处理技术主要有固相萃取、液液萃取和各种新型微萃取技术。液液微萃取法是在传统的LLE基础上发展的一种新型微萃取技术,克服了传统LLE消耗大量溶剂以及经典的SPE小柱操作繁琐且易堵塞等不足。尤其是中空纤维膜的引入使得LLME稳定性得到更大提升,在应用方面更为简便快速。三相中空纤维液相微萃取(3P-HF-LPME)具有富集倍数(EF)高、消耗试剂较少、使用成本低、易与色谱系统联用等优点,克服了传统方法的诸多不足,已用于环境、生物样品、药品等领域复杂样品中痕量成分的测定。

近年来色谱技术的飞速发展使其在植物生长调节剂的检测领域发挥了重要作用。高效液相色谱法(HPLC)无需昂贵和复杂的设备,又具备重现性好、准确可靠、通用性突出等优点,在中药材中PGRs残留量的测定中应用较广。本工作建立了基于3P-HF-LPME结合HPLC检测铁皮石斛和金线莲中3种植物生长调节剂的方法,通过建立、优化3P-HF-LPME萃取模型和条件,实现了在最优条件下对3种目标分析物的净化富集,降低了基质效应;为防止假阳性检测结果,采用质谱的全扫描模式对阳性样品作进一步的鉴定,以增强实验结果的可信度。

混合标准储备液:准确称取IAA、IBA、NAA标准品各10.0 mg于10 mL容量瓶中,加入甲醇溶解定容至刻度,配制成1.0 g/L的混合标准储备液,于4 ℃保存。

混合标准溶液系列:移取适量的混合标准储备液,用甲醇逐级稀释,配制质量浓度为100、50、10、5、1、0.5 μg/L的混合标准溶液系列。

样品溶液制备:称取烘干后的铁皮石斛或金线莲药材2.0 g,置于用锡纸包裹遮光的50 mL微量离心管中并加入30 mL甲醇,用匀浆机粉碎样品。将粉碎后的样品匀浆液超声30 min后,放置于4 ℃冰箱中浸提12 h。随后于35 ℃、 9000 r/min条件下离心15 min,吸取上层清液,向下层样品残渣中重新加入30 mL甲醇。重复上述操作2次,合并3次上清液并将其转移置于250 mL棕色梨形蒸发瓶中,在旋转蒸发仪上蒸发近干(温度为40 ℃),加入1 mL甲醇复溶,并加水定容至100 mL的棕色容量瓶中,用稀盐酸溶液调节pH至3.0,完成样品溶液的制备。

色谱柱:Welch Ultimate XB-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相组成:乙酸水溶液(pH 3.0)-甲醇(45∶55, v/v);等度洗脱;流速:1 mL/min;进样量:20 μL;检测波长:280 nm;柱温:30 ℃。

离子源:电喷雾离子源(ESI源);模式:正离子模式;扫描范围:m/z 50~400;扫描速度:358 u/s;接口电压:4.5 kV;加热块、接口和去溶剂化温度分别为250、350和250 ℃;雾化气和干燥气为氮气,流速分别为1.5 L/min和12 L/min。

中空纤维管使用前先剪成2 cm的小段,并用甲醇超声清洗10 min,经烘箱干燥后,用封口机将其中一端封口。取10 mL样品溶液或一定浓度的混合标准溶液置于15 mL棕色萃取瓶中(内置磁力搅拌子),加入1.50 g NaCl。用50 μL微量进样器将30 μL内相溶液(pH 11.0的NaOH溶液)注入中空纤维管内腔并封口。将两端封口的中空纤维管置于萃取剂正辛醇(中间相)中浸泡5 min,取出自然晾干以除去表面多余的萃取剂。将纤维管放入棕色萃取瓶内,置于恒温磁力搅拌器中,保持温度40 ℃,以1600 r/min的搅拌速度萃取2.0 h。萃取结束后取出中空纤维管,一端剪开吸取内相溶液,记录吸取的体积,并用流动相稀释20倍。经滤膜过滤后,用HPLC对其进行分析。