山东市监局发布《牡蛎疱疹病毒І型检测技术规范》

　   本标准规定了牡蛎疱疹病毒І型(Ostreid herpesvirus-1，OsHV-1)的巢式PCR检测方法，适用于对贝类样品进行疱疹病毒І型带毒情况的定性检测，以进行牡蛎疱疹病毒І型的流行病学调查、诊断、检疫和监测。

　　试剂

　　无水乙醇、TE缓冲液、抽提缓冲液、蛋白酶K、乙酸铵、Tirs饱和酚、Taq DNA聚合酶、MgCl2、溴化乙锭(EB)、PCR检测阳性对照、PCR检测阴性对照、PCR检测空白对照以灭菌双蒸水作模板

　　仪器

　　离心机、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、紫外仪、多功能振荡器、水浴锅或金属浴、-20 ℃普通冰箱、–80 ℃超低温冰箱、加热设备、微量移液器：量程0.5μL～1 000μL。

　　步反应体系及反应扩增程序

　　PCR反应体系如表1所示(25 μL反应体系)。阳性样品：牡蛎疱疹病毒І型DNA;阴性样品：健康双壳贝类组织DNA;空白对照：超纯水;检测样品：待检测样品组织DNA。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 sec、46 ℃退火30 sec、72 ℃延伸1 min，32个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。

　　第二步反应体系及反应扩增程序

　　取6.2.1中PCR扩增产物稀释100倍作为模板，以内引物C3、C2为引物进行PCR扩增，反应体系成分同步扩增反应。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 sec、48 ℃退火30 sec、72 ℃延伸35 sec，32个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。

　　结果表述

　　阳性结果报告为该贝类样本中存在牡蛎疱疹病毒І型DNA。阴性结果报告为该贝类样本中不存在牡蛎疱疹病毒І型DNA。

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