叶绿素测定仪：漫反射叶绿素仪原理与实例

漫反射式叶绿素测试技术的研究与实验

*作物叶绿素检测是农作物科学施肥或植物胁迫诊断的重要依据。是把作物营养科学管理延伸到作物生长的全过程，实现农业现代化不可或缺的技术措施。近十几年在教学科研领域广泛应用的叶绿素仪，可以在田间直接测定叶片叶绿素指数，具有无损伤、无耗材、低成本、GX率的特点。但其测值并不是叶绿素的含量，而是一个在一定条件下与叶绿素含量相关的指数。其相关关系具有很大的不确定性。所建立的相关模型往往只适用于具体的作物、品种和季节及特定的第几个叶片。因而给具体应用者带来较繁琐的建模工作量。本研究针对这一状态，试图开拓一种适用于作物不同品种、不同生育期的叶绿素含量直读测定仪。

一．叶绿素测定仪的现状与评价：

市场上的“叶绿素仪”都是透射式的。即通过检测光线透过叶片的光强来测算叶绿素含量。如SPAD502plus叶绿素仪:（日本柯尼卡美能达公司生产），CCM--200型手持叶绿素计（美国OPTI电器公司生产），atLEAF叶绿素仪（美国FT绿色有限公司产品），CL-01叶绿素仪（英国Hansatech公司产品）：他们普遍采用在两个波长（650-660nm，935-940nm）下叶片的的透射率作为基础数据，并把计算结果称作叶绿素指数，表征叶绿素含量的高低。例如SPAD502叶绿素仪的指数为SPAD值,CCM叶绿素仪的指数为CCI值。不同的厂家定义有不同的指数。

这种方法存在几个根本性缺陷：

1）当叶绿素含量高或叶片厚度大时，透射率过小。例如SPAD502规定其Zda测量叶片厚度为1.2mm，测值SPAD超过50时，精度不能保证。使用中也发现随着测值的提高测值曲线出现平台，且数据分散度加大。这是由于叶片透光度很低，当透射光强度小于或近似于光路、电路噪音时，就达到了测试极限。这是透射法的原理内在的固有性缺陷。

2）透射法的基础是朗伯-比尔定律，是在透明物质，可忽略其散射影响条件下建立的。但叶片是一种透明度很低的物质，其散射量是不可忽略的，因此透射法叶绿素仪必然只能在一个具体散射条件下相互比较，而叶片的散射随叶片内部组织、筋脉、基质背景变化而不同、这是透射法只能得到一个相对指数的根本原因，是又一个内在的原理性、固有性缺陷。

3）叶片叶绿素主要存在形态：叶绿素a和b，二者的光吸收系数不同，当叶绿素a和b的比例变化时，估算总量的模型必然就会出现失准。加以叶片背景散射条件也会发生变化，因此透射式叶绿素仪的估测模型在不同作物、不同生育季节是不能通用的，其指数和叶绿素含量的关系，需要重新进行建模或标定。带来工作量增加和校正误差的积累。

4）使用的1个工作波长（650~660nm）光源，和一个参考波长（940~950nm），测得的光吸收是叶绿素a(chlla)和叶绿素b(chllb)二者的光吸收的混合量，因此只能估测chla和chlb的总量，不能测知叶绿素chla和chlb的比例。而chla/chlb比值是作物病理诊断和栽培管理的的重要参数。

★透射法叶绿素仪自问世以来已有近30年历史，目前止步于估测叶绿素a、b混合总量，不能前进到叶绿素a、b比值。更不能由指数估测进展到定量估测。主要是受到了透射原理的制约，即使增加了波长也无法获取散射的信息。

二.漫反射式叶绿素仪研究与进展

1.漫反射式叶绿素仪的原理简述：

一束的光线照射在叶片上会产生吸收、透射和散射。漫反射式叶绿素仪是用一种特定工作波长的光源照射叶片，使用白板把穿过叶片的透射光再反射回来。在叶片内部二次吸收和二次散射。在叶片的入射光一侧接收漫反射光。工作波长的漫反射光强反映了叶片叶绿素的吸收和叶片的散射。另选一种参考波长（例如940nm）的光源，照射叶片。在该波长下叶绿素无吸收，其漫反射光强只与叶片内部的其他组织的吸收、散射有关。可用它来消除工作波长下的叶片组织散射和吸收的影响。得到只与叶绿素含量有关的反射光强。从而建立起漫反射光强与叶绿素含量的相关模型。由于品种变化、季节变化所带来的散射变化，在工作波长下与参考波长下有密切关联。可以根据参考波长的散射来修正工作波长下的叶片组织的散射量。因此这一模型大大减少了叶片品种、季节变化引起的散射的变化带来的模型误差。是模型具有必要的兼容性，使之在不同品种、在不同季节可以共用同一个模型。

目前，我河南农大迅捷测试技术公司研发了两种漫反射式植株营养速测仪。一种指数型（YN-XJZS型）是采用650nm做工作光源，它与SPAD-502相比较，波长项同，只是将透射改为漫反射，实现了测试叶片厚度和叶绿素浓度不受限制，工作曲线没有平台阶段，可以测定每g叶片叶绿素总量mg数。扩展了应用范围。另一种（YN-XJDL型）是采用波长645nm和663nm两个工作光源。由于采用两个工作波长，可以应用双波长原理计算出叶绿素A和叶绿素B的含量，进一步解决了叶绿素A和叶绿素B的定量估测。消除叶绿素A/B比值变化带来的模型误差。使本法所建立的模型在一定条件下具有相对普适性。从而大大减少建模的工作量。

本漫反射叶绿素测试技术，所依据的原理是在漫反射技术中普遍使用的库貝尔卡--芒克函数（Kubelka-Munkfunction）：

K/S=(1－R)2/2R----------------------1）

式中K、S,分别为吸收量系数和散射量系数；R：反射率，

但是该函数只是原理性描述，用以表述吸收、散射和反射三者的物理关系。其中K和S都没有单位。而且其R只在一定大小范围内时，其K值才与被测物质的吸光度有线性关系。也就是说迄今漫反射的理论还没有完全定量的函数描述。本研究是在其基础上，通过实验建立起经验模型。由于实验规模的局限性，其经验模型就不可能是普适的。本研究建立的模型的目标是在所实验的作物上在不同品种、不同季节得到叶绿素A和叶绿素B的准定量的数据，其误差平均在8%以内，Zda误差不超过15%.

2.漫反射式叶绿素仪的使用特点：

1）测试叶片部位和测试点的选择：由于不同的叶片，不同的部位的叶绿素含量不同、叶片基质也不同，所以测试点应能与建模时选择的测试点相同。并尽可能避开粗大的筋脉。这一点与透射式叶绿素仪（SPAD等）是相同的。但透射式叶绿素仪的模型对品种对季节不具兼顾性，所以全靠用户自己进行实验室实验来建模，自己选择测试点。而漫反射式叶绿素仪的模型具有这种兼顾性，可以制成某一作物专用仪。因此，使用者不必自己建模，只需按照说明书指定的叶片位置、测试点进行检测。当需要使用该专用仪测试其他作物，又不准备另购一台专用仪时，或当选择的叶片位置或测试点与说明书不一致时，就需要再做一次实验室常规测定，建立叶绿素仪测值与常规测值的简单换算关系（y=a+bx，x为叶绿素仪读数，y为叶绿素含量）。这样就可以把一种作物的叶绿素专用仪扩展为多种作物共用的叶绿素仪。

2）叶片测试方向：叶片的两面表面状态不同，要选择无绒毛的、较光洁。较平整的一面面对入射光方向。以免部分入射光被绒毛反射后进入检测器，而这部分进入检测器的光未能进入叶片内部，不能反映叶片内的叶绿素的吸收和散射，只能是一种随机干扰，会带来误差。它对漫反射式仪的影响大于对透射式仪的影响。

3）漫反射式叶片测试数据分散性一般大于透射式数据。其原因在于它不仅受到叶片群体叶绿素含量变异的影响，还受到叶片群体叶片内部组织变异的影响。但是这些变异都是随机的，并不影响测值的总体精度。

参见下表：

引自2014年10月29日YN-XJZSdiyi代样机某实验记录。（数据量过小，数据只用于分散度对比）

4）测试数量：不论透射式还是漫反射式叶绿素仪，其目的都是测定作物群体的营养状态，而不是单个叶片的营养状态。因此必须有一定的叶片测试数量，剔除粗大误差后以其平均值代表作物的叶绿素A和B的含量。增加测试数量，可以提高测试精度，一般30-40个叶片就可以满足判断叶绿素丰缺的测试精度要求。Zdi不应少于20个叶片.当用于建模时建议取40-60个叶片。继续增加叶片数量的效果有限。漫反射式叶绿素仪的测值既受叶绿素含量分散相的影响，又受叶脉和内部组织分散性影响，因而测值的变异性略大于透射式叶绿素仪，但是由于都是随机的变异，所以不影响平均值的精度。

4）必须保持反射板的清洁和表面状态：反射板俗称（白板）是由低密度聚四氟乙烯材料制成，它是漫反射式叶绿素仪的基准组件。使用时需注意不要用手触及其表面。当表面脏污时仪器会自动提醒进行维护或更换，维护时按照说明书要求进行。

3.漫反射式叶绿素仪的已达到的指标：

1）解决了深色叶片、大厚度叶片的检测的适应性，叶片厚度未受限（＞8mm），远远超过SPAD叶绿素仪的叶片厚度上限（1.2mm）。叶绿素线性区间未受限制（＞0-8mg/cm2），叶绿素曲线无平台。远远超过SPAD指数的线性区间上限（50SPAD，相当于mg/cm2）。

附图：透射式和漫反射式仪器的测值曲线（待补）.

2）解决了当前国内外叶绿素仪只能提供一个指数，不能提供叶绿素值的问题。把叶绿素的无损快速测定由半定量估测提高到定量估测，直接显示叶片叶绿素含量。其叶绿素读数与Arnon法测定的测值相比较，按Z近实验，其平均相对偏差为5.97%，相关性R的置信水平达0.01以上（9种树叶，见表1）

3）直读叶绿素A、B的各自含量，直读其比值：chlla/chllb。该比值与Arnon法测定的比值相比较，其平均相对偏差为4.28%：（9种树叶，见表1）

表1：叶绿素模型兼容性检验

注：前5项作物数据用于建模，后4项作物数据用于模型兼容性检验

漫反射式叶绿素仪在建立了某种作物的兼容性计算模型之后，用户可以摆脱自己建模对实验室的依赖，就能直接进行叶绿素含量的定量检测，无损伤、无耗材。快捷、方便，是目前作物营养检测的理想工具。但是操作人员必须了解漫反射的特点。按照操作要求维护使用，才能保证测试精度。

四．结语：

透射式叶绿素仪面世以来，推动了植株营养的检测技术的应用，但它不能进行定量估测，用其指数建模又不具对不同生育期、不同品种的兼容性。因而迄今只是在研究单位中得到应用，不能普及到基层用户。其根本原因是叶片的非透明性，透射原理不适于检测具有较强散射性的物质。漫反射式叶绿素仪不仅可以获取叶片的叶绿素吸收信息，还可以获取叶片的散射信息。因而其模型具有一定的普适或兼容性，可以对叶绿素进行定量估测，但由于漫反射理论尚未成熟，没有精确地计算式，也没有适用的标准物质进行校准。不得不使用经验公式进行估测，所以目前只能做到准定量。但初步实践表明，其精度可以满足作物生育期营养监测的要求。为了该技术在农业生产中发挥应有的作用，需要作物营养与施肥战线的技术人员共同努力，与制造厂家合作，给农民提供各种作物的专用模型和施肥技术指标体系。作为漫反射式叶绿素仪的创始研制者，我河南农大迅捷测试技术有限公司愿与各位专家学者合作，利益共享，共同完成这一义举。

河南农大迅接测试技术有限公司

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