崔市磊

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最新更新：2021-07-19 12:56:56

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单克隆抗体制备

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【导读】 1：动物的选择与免疫　目前进行杂交瘤技术的研究多选用纯种BALA/C小鼠。纯种BALB/C小鼠较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养...

1：动物的选择与免疫

　目前进行杂交瘤技术的研究多选用纯种BALA/C小鼠。纯种BALB/C小鼠较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立的免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性进行设定。用于免疫的抗原大致可分为两类：可溶性抗原和颗粒抗原。

可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂有福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。初次免疫时，将1～50μg抗原加福氏完全佐剂进行皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）。3周后进行第二次免疫，抗原的剂量同初次免疫，加入福氏不完全佐剂进行皮下或腹腔内注射，腹腔内注射剂量不宜超过0.5ml。3周后进行第三次免疫，剂量同初次免疫，不加佐剂，腹腔内注射后5～7天即可采血测其效价。过2～3周后需进行加强免疫，剂量以50～500μg为宜，采取腹腔内注射或静脉内注射。3天后即可取脾融合。

　　目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：可将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。或者改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。同时使用细胞因子作为佐剂，也可提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。

与可溶性抗原相比，颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。

2：细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测

1．细胞融合

细胞融合前准备：

（1）瘤细胞系的选择：瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。用于融合试验的主要瘤细胞系有P3/X63-Ag8（X63）、P3/X63-Ag8.653（X63-Ag8.653）、P3/NSI-1-Ag4-1（NS-1）、P3/X63-Ag8.Ul（P3Ul）、SP2/0-Ag14（SP2/0）、F0、S194/5.XXO.BU.1、MPC11-45.6TG1.7、210.RCY3.Ag1.2.3、GM15006TG-A12及U-266AR等。

瘤细胞可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基进行培养。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×105/ml为宜，Zda浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。

　在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节均需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量一般为2×104或105细胞/孔。

（2）细胞融合的步骤

细胞融合一般包括制备饲养细胞层、制备免疫脾细胞、制备瘤细胞及融合等四个步骤。

制备饲养细胞层时一般选用小鼠腹腔巨噬细胞，与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周后拉颈处死；浸泡在75%酒精内，3～5min后用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管），反复冲洗，吸出冲洗液放入10ml离心管，1200rpm分离5～6min后，用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml，进行培养。

　　制备免疫脾细胞时先将Z后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死，无菌取，培养液洗一次后，将研碎，过不锈钢筛网后离心，细胞用培养液洗2次，计数后取108脾淋巴细胞悬液备用。

　　制备瘤细胞时应取对数生长瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次，计数后取1×107细胞备用

　　融合时先将瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心后弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。在90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml的不完全培养液以终止PEG作用。离心弃上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫可接种4块96孔板。将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。

2.杂交瘤细胞的选择及抗体检测

（1）HAT选择杂交瘤细胞　　　

脾细胞和瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。

　　在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。

（2）抗体的检测　　

检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。放射免疫测定（RIA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）及免疫荧光试验为常用的检测方法。

放射免疫测定可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测；酶联免疫吸附试验可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测；免疫荧光试验则适合于细胞表面抗原的McAb的检测；其它还有间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等方法。

3：杂交瘤的克隆化及冻存与复苏

1.杂交瘤的克隆化

　　杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所YZ，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

　　克隆化的方法很多，Z常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。

2. 杂交瘤的冻存与复苏

杂交瘤细胞的冻存：及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。

　　杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以装一支安瓿冻存。50%小牛血清、40%不完全培养液及10%DMSO（二甲基亚砜）是常用的细胞冻存液。冻存液Z好预冷，操作时动作要轻且迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

细胞复苏方法：将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5%CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。

4：单克隆抗体的大量生产及鉴定

1.单克隆抗体的大量生产

　　大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：

（1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为10～60μg/ml,如果大量生产，费用较高。

（2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

2.单克隆抗体的鉴定

　　对制备的McAb进行系统的鉴定主要包括以下几个方面：

（1）抗体特异性的鉴定　　

除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如：制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应该用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体

（2）McAb的Ig类与亚类的鉴定　　

一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定。在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3%），更有利于沉淀线的形成。

（3）McAb中和活性的鉴定　　　

用动物或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如，如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

（4）McAb识别抗原表位的鉴定　　

用竞争结合试验，测相加指数的方法测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。

（5）McAb亲合力的鉴定　

用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲合力。

2004-07-19 09:04:13

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