杨俊海

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最新更新：2021-07-19 13:09:27

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细胞污染过程中常见的微生物污染和预防

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【导读】导语你正在细胞科学的海洋愉快遨游，如果有一天，细胞污染忽然跑过来说：“大家好，我是细胞污染~”这时候，科研的小船说翻就翻。今天Esco就同大家浅谈细胞污染，抛砖引玉。体外细胞污染分...

导语

你正在细胞科学的海洋愉快遨游，如果有一天，细胞污染忽然跑过来说：“大家好，我是细胞污染~”这时候，科研的小船说翻就翻。

今天Esco就同大家浅谈细胞污染，抛砖引玉。

体外细胞污染分类:物理性、化学性、生物性污染。其中生物性污染常见且造成的后果也较为严重，培养的细胞一旦遭到微生物污染，将具有不可逆转性。轻则污染细胞废弃，重则连带污染培养箱内的其他细胞，甚至整个实验室的环境，给科研工作带来严重的损失和威胁。

一、怎样判断你的细胞是何种生物性污染？

1.细菌污染

常见细菌种类为大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌等(革兰阴性菌)、葡萄球菌等(革兰阳性菌)，其中革兰阳性菌较为多见。

主要来源：操作不当或是器材消毒不严，或是各种营养成分隐性污染细菌没有被检测出来所造成的。

特点：污染速度快，易被发现。多数情况下细胞培养液短时间内变黄，培养基1～2d就会变浑浊，pH值降低，倒置显微镜下观察，可见胞浆出现大量颗粒，细胞变圆或崩溃，从壁上脱落，培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮，呈细沙状，污染较轻时可见小菌体在细胞间运动。

图1细菌污染

图2洋葱佰克霍尔德菌污染

2.真菌污染

污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。

主要来源：实验人员（实验服）

特点：短期内不会引起培养液的浑浊，可在培养液中形成白色或黄色漂浮物，一般肉眼可见，较易被发现，4d左右才可在高倍镜下观察到丝状、管状或树枝状菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。

图3真菌污染

图4霉菌（丝霉）污染培养基呈淡紫色，或不变色，但会变得粘稠，并且具有季节性，长蘑菇的季节很容易污染这种菌类。

念珠菌污染呈链状排列，呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。

图5白色念珠菌污染常见的细胞污染之一，左侧为倒置显微镜下视图，右侧为革兰氏染色图片，其中，长梭型的是处于分裂期的链珠菌

酵母污染很容易观察到，培养物变浑浊，尤其在后期。一般pH值变化很小，严重时，pH值升高。显微镜下呈卵圆形或球形颗粒，有些会芽生较小颗粒。

图6酵母菌污染

3.支原体污染

支原体是一类无细胞壁、大小介于细菌和病毒之间（直径在0.13～0.18μm）并独立生活的微生物，可穿过0.22μm的孔径滤膜！光镜下难以看清它的形态结构！并对青霉素有抗药性！简直就是细胞培养界的隐性杀手有木有！

主要来源：血清

特点：支原体污染不能用肉眼或光学显微镜检查细胞观察出来，带有一定的隐蔽性，易被人们忽视。当细胞被支原体污染后，在光镜下常可见到细胞核及胞浆内出现大小不等的颗粒或空泡，细胞营养液可能毫无变化，短期内细胞没有明显的病理变化，也可以因为传代或换液而缓解。只有当污染严重时才影响细胞增殖，使细胞脱落。支原体可以与宿主细胞形成一个共生关系，使污染不断扩大。一旦发生支原体污染，支原体可以通过移液、倾倒液体时产生具有潜在感染力的飞沫和吸附的尘埃，沉积在物体表面。这种污染性尘埃能存活数天甚至数周，使操作环境受到污染，若不及时处理还会产生交叉污染或再次污染。

检测：常用的检查方法为培养检测法，即取1mL细胞培养液加入支原体液体培养基中，培养5天后，观察培养基的颜色变化。如果变黄则怀疑该细胞受到支原体污染。如果不变色，则盲传一代。若颜色变黄，可接支原体固体培养基，于5%CO2培养箱中培养3～5天，观察有无“煎蛋”状支原体菌落。一旦发生污染即淘汰该细胞和培养液。

图7支原体污染煎蛋状和其他形状，左侧：电镜照片(×30k)；右侧：电镜照片（×12k）

此外，支原体污染还可用荧光染色法和相差显微镜观察法等检测方法,或者直接购买支原体检测试剂盒进行检测。

4.黑胶虫污染

黑蛟虫是一种生物还是非生物，学术界还有争论。可以穿透滤膜，也可以通过空气传播。

主要来源：血清

特点：开始污染时对细胞无影响，当数量达到一定程度时就会对细胞产生影响。400倍显微镜下可见点状或片状游动小体。，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。

5.病毒污染

尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

主要来源：动物血清或者细胞系，常见于杂交瘤细胞。

特点：极为隐蔽，很难用常规的方法检测到。受病毒污染的细胞液通常清亮无变化，大多数受病毒污染的细胞不会产生形态变化及细胞病理现象，少部分病毒会造成细胞变圆、肿胀，脱落。

检测：可用血细胞吸附试验、免疫荧光抗体法及电子显微镜法有效检出病毒。通常病毒物污染的清除是十分困难的，可以重新引入高质量的细胞株。

6.非同种细胞污染

即细胞交叉污染，一般来自细胞建株和细胞传代过程中两种或两种以上细胞之间的混合污染。一种是由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染，另一种情况则是提取原代细胞时在消化过程中由于剪割的组织块不够纯，消化时间把握不好，容易把杂质细胞消化混入原代细胞培养中。

二、预防细胞污染

1.室内环境

(1)细胞培养室要有操作间、缓冲间和更衣室；

(2)房间装修密闭性较高，且不宜开设外窗，无菌间的房顶、墙壁和地面均应光滑、无死角，室内应有紫外线杀菌装置；

(3)实验台和仪器布局应合理。一般来说，二氧化碳培养箱和净化工作台或生物安全柜不应对着门摆放，离心机和显微镜不应离得太远。

2.实验用品

(1)购买合格的细胞，并留种冻存，必要时可将细胞悬液加入肉汤培养基或琼脂培养基中，观察是否有微生物滋生；

(2)细胞培养所用物品的清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌CJ要仔细，操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌；

(3)细胞培养过程中涉及到的自行配制的溶液要经过高压湿热灭菌（如水、磷酸盐缓冲溶液等）或0.22μm无菌滤膜过滤（不耐高温的溶液）、并检测确认为无菌后，方可使用；

(4)不同细胞在传代或换液时所用器具应严格区分，避免细胞间交叉污染。

3.实验人员

(1)操作人员进培养室前，必须先洗手，在缓冲间换穿专用实验服和拖鞋，严禁在实验进行时频繁出入培养室；

(2)操作要准确、敏捷、有序；

(3)吸取溶液时，应专管专用，避免交叉污染；

(4)吸管管口要向下倾斜，以防止液体倒流进入移液器内发生污染；尽量减少细胞和培养基的敞口时间；

(5)已开口的试剂瓶尽可能的倾斜放置，防止下落微生物的污染；

(6)避免在敞口的细胞培养皿及培养皿盖上方操作；不要面对工作台或细胞培养箱讲话或咳嗽，防止口腔微生物随唾沫飞入而发生污染；

(7)若发生外溢，用蘸有消毒酒精的棉球及时擦去；

(8)实验后应将实验产生的废物和废液及时清理出培养室，并清洁无菌工作台。

三、结语

读完了本文，您是否对细胞污染有了更多的了解呢？您知道应该怎样预防细胞污染了吗？

之前Esco发过题为《如何保护您的培养细胞免受污染》一文，如果感兴趣的话，可以前往我们的展开了解，或者关注Esco生命科学的微信公众号：Esco_China，进一步了解更多关于细胞培养的相关内容。

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2004-07-29 09:50:25

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