Hifair^® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)

Hifair^® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)基于Hifair^® Ⅲ Reverse Transcriptase而开发的即用型预混液。与Hifair^® Ⅱ Reverse Transcriptase相比，Hifair^® Ⅲ Reverse Transcriptase热稳定性大幅度提高，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，非常适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。

该预混液包含5×gDNA digester Mix和4×Hifair^® Ⅲ SuperMix plus。5×gDNA digester Mix可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。4×Hifair^® Ⅲ SuperMix plus 含有逆转录反应所需的所有组分（Buffer，dNTP，Hifair^® Ⅲ Reverse Transcriptase，RNase inhibitor，Random primers/ Oligo (dT)₁₈ primer mix），只需加入RNA模板和 RNase-free H₂O即可进行逆转录反应，并同时终止gDNA digester的作用，保证cDNA的完整性。

该产品适用于两步法RT-qPCR检测，针对qPCR进行特别优化，比例优化的Random primers/ Oligo (dT)₁₈ primer mix，使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始，并具有相同的逆转录效率，最大程度保证了qPCR结果的真实性和可重复性。逆转录产物兼容SYBR^® Green和探针法qPCR，可以根据实验目的，选择Hieff UNICON^® qPCR SYBR^® Green Master Mix，Hieff^® qPCR SYBR^® Green Master Mix或Hieff^® qPCR TaqMan Probe Master Mix等试剂配合使用，进行高性能的基因表达分析。

产品组分

【注】：4×Hifair^® Ⅲ SuperMix plus含有gDNA digester抑制剂。

产品应用

适用于两步法RT-qPCR。

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃保存。有效期18个月。

注意事项

1）5×gDNA digester Mix和4×Hifair^® Ⅲ SuperMix plus含有高浓度的甘油，使用前请短暂离心收集到反应管底部，并用移液枪轻轻吸打充分混匀后，准确吸取；

2）如果加入RNA模板体积较大 (如超过2 μL)，请确保RNA是溶于水中而不是TE中，因为TE会对gDNA去除以及逆转录反应产生抑制；

3）可以不经过基因组去除步骤，直接用4×Hifair^® Ⅲ SuperMix plus进行逆转录，这样所得到的结果会与使用Hifair^® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix  (Cat No.11137ES) 效果一致。但是请勿将gDNA digester与11137ES中的Hifair^® Ⅲ SuperMix配套使用，因其不含终止gDNA digester反应的成分，会影响反转录和后续的qPCR实验；

4）反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染；

5）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作；

6）本产品仅作科研用途！

第一链cDNA合成操作步骤

1. 残留基因组DNA去除

在RNase free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

【注】：* 20 μL逆转录反应体系建议Total RNA的投入量不超过1 μg。如果目的基因的表达丰度低，最多投入5 μg Total RNA，否则RNA投入量过高，可能会超过后续定量PCR的线性范围。

2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

在第1步的反应管中直接加入4×Hifair^® Ⅲ SuperMix plus，用移液器轻轻吹打混匀。

3.逆转录标准程序设置

【注】：逆转录温度：推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃。

   逆转录快速程序设置

【注】：逆转录快速程序适用于中低GC含量（≤55%）或者简单模板。

※ 逆转录产物可立即用于qPCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

HB221101