采用实时荧光PCR技术，针对致泻大肠埃希氏菌（DEC）特异性基因设计引物和探针。PCR扩增过程中，与模板结合的探针被Taq酶分解产生荧光信号，荧光定量PCR仪根据检测到的荧光信号绘制出实时扩增曲线，从而实现致泻大肠埃希氏菌（DEC）在核酸水平上的菌株鉴定。

1、核酸提取

加热法：刮取一环菌落，悬浮于100μL的无菌水中，漩涡震荡10s（如果菌落未能均匀分散，可适当延长震荡时间），95℃或沸水浴5min，冷却至室温，12000rpm离心5min，吸取上清。

试剂盒法：可使用商品化的试剂盒提取细菌的基因组DNA。

2、反应体系配置

从试剂盒中取出预混液，充分融化，涡旋后短暂离心，取20μL置于PCR管或PCR板中，然后各取模板5μL分别加入PCR管或PCR板中（每种模板要使用五种预混液），盖好管盖或板膜，短暂离心，立即进行PCR扩增反应。

3、PCR扩增

PCR管或PCR板置于PCR仪上，推荐反应程序设定如下：反应体系为25μL，在第二步每个循环60℃时检测荧光信号，检测通道选择FAM、HEX（VIC）、ROX、CY5。

注：使用ABI系列PCR仪器，如果不添加ROX，“passive reference”和 “quencher”均选择“none”。