寡核苷酸分离技术

寡核苷酸分离技术

合成寡核苷酸和DNA片段被应用于迅速发展的应用领域，包括作为主体或杂交探针用于ZL性制剂。沃特世寡核苷酸分离技术(OST：Oligonucleotide Separation Technology)基于BEH杂化颗粒的反相色谱柱，以及Gen-Pak离子交换柱，应对各种高分辨分析与实验室规模分离挑战所需，包括涉及各种DNA和RNA品种。

沃特世OST色谱柱装有键合了C 18 的第二代杂化技术BEH颗粒。对去三苯甲基(detritylated，或称脱保护)的合成寡核苷酸样品的分离，基于成熟的离子对反相色谱法。沃特世提供1.7 μm UPLC颗粒或2.5 μm HPLC颗粒，装填以各种不同色谱柱规格，从而灵活满足各种实验室规模分离或分析的不同需求，并能实现异乎寻常的样品分辨率和卓越的色谱柱使用寿命。此外，沃特世的制造和质控测试程序，有助于确保批次之间与柱之间的性能的一致性，而无论应用的难度有多高。

1、分离效率相当于或优于PAGE、CGE、或离子交换HPLC方法

2、可从去三苯甲基(脱保护)的全长产物中分辨出失败序列

3、可放大的柱规格，满足实验室规模的分离需求

4、超长的色谱柱使用寿命，降低单次分析或分离成本

5、经MassPREP OST标准品质控测试，帮助确保性能稳定

对寡核苷酸混合物具有异乎寻常的高分辨率

ACQUITY UPLC OST C 18 ，1.7 μm色谱柱(设计专用于ACQUITY UPLC系统)和XBridge OST C 18 ，2.5 μm色谱柱，能完全适用于离子对反相色谱法分析和纯化去三苯甲基寡核苷酸的需求。如图所示(右图)，使用沃特世UPLC技术所进行的分离，具有与毛细管凝胶电泳(CGE)相媲美的组分分辨率，而且分析时间显著缩短。由于使用亚2 μm BEH技术颗粒提高了分辨力，因而有可能对大寡核苷酸序列进行分离(如将N与N-1分开)。此外，使用沃特世OST色谱柱配合质谱联用技术以及对质谱兼容的洗脱剂，有可能对与失败序列的色谱分离开的目标寡核苷酸产物的分子量特征进行定量分析。

分离15-60mer去三苯甲基寡脱氧胸苷序列组(Detritylated Oligodeoxythymidine Ladder)

分离去三苯甲基寡脱氧胸苷序列组，比较毛细管凝胶电泳(CGE)与离子对反相色谱方法的分离效果

纯化单链RNA

干扰RNA寡核苷酸的UPLC/MS分析

RNA干扰(RNAi)机制的发现现在被广泛用于静默目标基因表达，这推动了对小分子干扰RNA(siRNA)分析的需求。为满足对20-25个核苷酸的小分子干扰RNA(siRNA)进行耐用的、快速的、灵敏的分析的需求，沃特世开发了一个UPLC/MS方法，运用了UPLC OST色谱柱和Synapt HDMS质谱仪。

采集准确质量可对5’-截断寡聚体(寡核苷酸合成过程所产生的失败序列)以及其它一些杂质峰进行分配。质谱图中的质量的每个峰均使用MaxEnt 1软件进行去卷积化。图2给出了推测性的5’-端失败产物。对寡核苷酸母体的几乎完整序列均进行了解释。质谱分析还显示除了目标21-mer RNAi序列以外，还存在一个额外的尿苷单核苷酸。

对一个21mer的RNA进行LC/MS分析

不同离子对试剂对不同寡核苷酸序列分离的影响

杰出的柱寿命

在这些苛刻的分离条件下，填充以BEH技术颗粒的沃特世OST色谱柱显示出引人注目的柱寿命，同时还具有并保持卓越的分离性能。而在相同的苛刻分离条件下，传统硅胶基质色谱柱的使用寿命显著缩短。

分离5-25mer去三甲苯基(脱保护)寡脱氧胸苷序列进样1000针柱分辨率没有任何变化

寡核苷酸分离技术(OST)柱产品一览表

产品描述 粒径 孔径 柱规格 部件号

ACQUITY UPLC OST C 18 * 1.7 μm 135 2.1 x 50 mm 186003949

ACQUITY UPLC OST C 18 * 1.7 μm 135 2.1 x 100 mm 186003950

ACQUITY UPLC OST C 18 * 1.7 μm 135 2.1 x 150 mm 186005516

ACQUITY UPLC OST C 18 方法验证包** 1.7 μm 135 2.1x 100 mm 186004898

ACQUITY UPLC OST C 18 定制柱* 1.7 μm 135 定制 186003951

XBridge OST C 18 2.5 μm 135 2.1 x 50 mm 186003952

XBridge OST C 18 2.5 μm 135 4.6 x 50 mm 186003953

XBridge OST C 18 2.5 μm 135 10 x 50 mm 186003954

XBridge OST C 18 方法验证包** 2.5 μm 135 4.6 x 50 mm 186004906

XBridge OST C 18 定制柱 2.5 μm 135 定制 186003955

* 用于配合沃特世UPLC系统使用

**来自于不同批次填料所装填的三根色谱柱

可放大的DNA与RNAi分离，良好的产品回收率

研究基因静默、或用于基因敲除时，需要高纯度寡核苷酸。XBridge OST C 18 色谱柱，具有极高分辨率，其柱规格设计用于满足实验室规模的分离需求，是纯化去三苯甲基(脱保护)寡核苷酸的色谱柱。如下表所示，XBridge OST C 18 色谱柱规格和操作流速的选择，主要取决于合成反应混合物的规模大小。我们建议根据寡核苷酸样品的载量选择适当的色谱柱规格，这样可使组分分辨率最大化，使目标产物与不要的失败序列分离开得到最大回收率。

柱规格 大概样品载量** mg*** 流速

2.1 x 50 mm 0.04 μmoles 0.2 mg 0.2 mL/min

4.6 x 50 mm 0.20 μmoles 1.0 mg 1.0 mL/min

10 x 50 mm 1.00 μmoles 4.5 mg 4.5 mL/min

19 x 50 mm* 4.00 μmoles 16.0 mg 16.0 mL/min

30 x 50 mm* 9.00 μmoles 40.0 mg 40.0 mL/min

50 x 50 mm* 25.00 μmoles 110.0 mg 110.0 mL/min

* OST订制柱

** 所列数值仅为约值，且取决于寡核苷酸的长度、碱基组成、以及所采用的“切取中心”的馏分收集方法。

*** 按平均寡核苷酸分子量及合成产率估算

将siRNA Duplex与其相关杂质分离开