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过短的PCR产物为什么不适于直接测序?

wangzy0709    2010-11-25    PCR纯化    浏览 656 次

精彩问答
a520131400701 发布日期:2010-11-29
首先过短的PCR产物纯化困难,一般的PCR产物纯化试剂盒都要求PCR产物片段大于150bp,过短的 PCR产物纯化和准确定量都非常困难。因此我们要求用于测序的PCR产物一般不低于150bp长度。其次,由于测序技术本身的限制,测序反应对环境的干扰比较敏感,模板太短的PCR测序受外界的 干扰更大,很容易造成测序失败。--------转自三博远志网站(测序FAQ)
全部评论
宋澈钟意勋 发布日期:2010-11-27
这里有两个问题,pcr产物测序和pcr过短的问题
熟悉pcr产物测序原理就明白,前面20-30个bp测出来市数据是不准确的,测序范围大概是800左右,超过的需要双向测序。
过短的pcr产物,pcr测序肯定需要纯化的,如果太短的话,在胶回收的时候很可能影响pcr产物浓度。一般pcr送样测序的条件A未纯化PCR产物的要求,1. 片段大于200bp;2.请提供50ul PCR扩增产物(总量1ug-2ug);3.取3ul样品,应该能够清晰的分辨出目的条带; 自带引物,引物浓度不低于5uM,并请注明。B纯化后PCR产物的要求1.PCR产物溶于蒸馏水中(请勿溶解在TE溶液中);
2.浓度大于20ng/ul,体积大于10ul,长片段需适当增加量;3.电泳检测条带专一; 自带引物
价格都不是很贵,一般能22-25元一次。
潜新儿 发布日期:2010-11-26
目前用的测序仪一般是基于PCR方法的sanger法原理,
那么用你的PCR产物为模板,测序引物从Z两端开始,么测序时由于测序仪的毛细电泳管分辨率问题,测序引物后的50个左右长度碱基测不出。
测序仪通常从测序引物起延伸50个左右bp后,才能分辨,读出序列。

当然,如果你用第三代或第四代测序技术, 称为next generation DNA sequencing 或next next generation DNA sequencing,那么再短的PCR产物也能测出来。这种新的测序方法通常Z长也就是测50到60bp。
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