姚坤华
发布日期：2017-09-02
变性梯度凝胶电泳（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis， PCR-DGGE）和FISH一样，也是一个常用的分子生物学实验，在环境生物技术领域常用于分析微生物群落的多样性。
DGGE实验的大体操作流程如下：
1. PCR扩增
与普通PCR不同之处是Primer上要加一个GC夹（GC Clamp)，GC夹的序列为：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC
常用的细菌16S通用引物341fGC/518r的序列如下：
341fGC: 5′-CGCCCGCC GCGCGCGGC GGGCGGGG CGGGGGC ACGGG GGGCCTACG GGAGGC AGCAG-3′
518r: 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′
2.制作凝胶
需要的准备的试剂：
(1)新鲜配制的Ammonium Persulfate Solution（APS） 0.1g in 1ml H2O
(2)四甲基乙二胺(TEMED)
(3)0%和变性剂（的变性剂不容易溶解，可以用80%的来代替），配制方法见Z下面的表格
准备四种不同浓度的凝胶：
顶层胶： 4ml 0%变性剂+4微升TEMED+40微升APS溶液
底层胶： 1ml 80%变性剂+4微升TEMED+40微升APS溶液
如果DGGE需要的变性剂梯度为40%～60%，需要配制40%和60%变性剂凝胶溶液各约13ml：
40%变性剂凝胶溶液：6.5ml 0%变性剂+6.5ml 80%变性剂+13微升TEMED+130微升APS溶液
60%变性剂凝胶溶液：3.25ml 0%变性剂+9.75ml 80%变性剂+13微升TEMED+130微升APS溶液
如需其它梯度，请重新计算。
这几种溶液加在一起后，很快就会凝固，所以混合之前一定要准备好凝胶制作装置。具体制作方法请参考凝胶制作装置的说明书。我们实验室用的是Hofer Gradient Maker，感觉效果还可以。
3. 电泳
将PCR产物和Loading buffer混合后加入胶孔，温度设定为60度，然后开始电泳。不同样品需要的电泳的电压和时间可能不同，需要优化一下，根据我的经验，120V， 6h对很多样品都比较和合适。
4. 染色
用万分之一的EB或SYBR Green I染色， 我比较了一下发现EB效果明显优于SYBR Green I。染色时间5分钟～30分钟都可以，染色时间太长效果并不一定好，我通常染5分钟。
5. 拍照
染色后小心地将凝胶转移到gel documentation system中拍照，要尽快操作，否则在紫外光的作用下，很快图像的效果就会降低。
6. 结果分析
如果需要对DGGE结果进行定量分析，请参考：用Quantity One进行定量分析的方法
需要说明的是，这种定量方法并不是很准，而且因为进行了PCR，定量有很多问题。
