农药有效成份分析方法的线性相关性测定

1．范围
准则
主要适用于制剂的分析方法，也可用于原药中有效成份的分析，部分可用于物理方法「见3、（2）②节」，但不适用于残留或微量分析。
本准则推荐的方法，如专用于要提交给PSD研究时，应达到欧共体统一原则草案中对制剂分析确认的主要技术要求。
2．定义
（1）误差：本准则中确认的误差类型有： ①偶然误差：此类误差通常微小，由偶然误差导致的结果，多数接近于平均值范围，换句话说，由它们决定方法的重复性或再现性。 ②系统误差：此类误差使所得结果偏离，其平均值高于或低于实际值（如方法中某些误差可导致不正确结果）。
（2）精密度：精密度是偶然误差的基度，可用重复性和再现性表示，此类术语在ISO5725－1986E中均有说明。 ①重复性指采用相同方法，在同一实验室用同一试验物质，同一操作者使用同一设备，在短时间间隔内，在相互独立试验中所获得结果的一致性。 ②再现性指采用相同方法，在不同实验室用同一试验物质，由不同操作者使用不同设备所得试验结果的一致性。
3）准确度：方法的准确度指所得结果与分析样品中真值的符合程度。
4）统性：试验方法的线性指在一定范围内所得试验结果与分析样品浓度（剂量）成比例的性能。
5）特异性：方法特异性定义为对所分析的特定样品产生的特定信号。
3．方法确认
可以认为大多数农药制造商具有确认分析方法的措施，但制造商责任在于保证这些措施能遵守本准则的技术要求。 应提出以下几方面资料对方法进行确认：
在方法中被分析物质（和内标物，如适宜）响应的线性。 分析方法精密度的评价。 分析方法准确度的证明。 赋形剂中无干扰物的证明。 被测定物质种类的确定。 某方法被广泛使用时，虽然其再现性很重要，但不必将其评价收入准则，如需要可通过全面的CIPAC或AOAC协作研究作Z好评价。1）线性：分析物质响应的线性范围，至少应大于分析物标明浓度的±
20％。至少测定3个浓度，每个浓度测定两次，应附上此线性图、斜率、截距和相关系数等数据。测得的斜率可证明响应与分析物浓度之间有明显的相关性。在标明值±20％范围内，其结果不应与线性有显著偏离，即相关系数（y）应＞0.99，否则提交方法必须同时提供如何保持本方法有效性的说明，如故意使用不成线性响应的方法，也必须提出解释。（2）精密度： ①化学分析：在此类准则中要求对重复性简单评价即可。至少作5次重复样品的测定，同时简单评价其结果，包括相对标准偏差RSD％。如认为合适，对测定中偏离数据可用Dixons或Crubbs试验检验，但要舍去某些结果时，必须明确指出，并应设法解释为何产生偏离的数据。数据结果的合格性应以修改的Horwitz公式为依据： RSDy＜2（1－0．51ogc） X 0.67
式中C一样品中分析物浓度，以小数计。 Horwitz公司的推导和使用实例列于（附件1）中。
②物理化学性能测定：当进行物理或物理化学性能测定时，使用官方方法（如 CIPAC或oECD）即不需要再予确认。本原则亦适用于对此类方法略有改动的情况，如使用其他方法时，必须测定其重复性，但无须遵守Horwitz公式。（3）准确度：评价方法的准确度，至少需要4个已知被分析含量实验室制备的“合成的”制剂进行测定，其结果可用students t统计或附件Ⅱ中其他适用方法检验。（4）非分析物质的干扰：在评价准确度时，通常包含非分析物质的干扰，因赋形剂中的任何干扰物均会导致分析方法出现系统误差。然而分析时应同时测定不带赋形剂的空白样品，或证明其无干扰，如有干扰时可测定数量，样品色谱图和其他结果均应附上。当原药有效成份中有特定杂质时，必须证明在相同分析条件下此类杂质的响应值不应大于被分析物或内标总峰高的3％。如有此类偏离，必须在提交报告中说明其数据是否已经校正。（5）特异性：方法特异性应以被分析物质的特点来确定，通常对此类化合物进行质谱测定，如使用GC／MS，LC／MS的Th极管陈列检测器或峰收集后使用质谱测定。在使用色谱法测定时，通常以此作为鉴别有效成份或确认分析标准品的方法。当制剂分析是根据其中一种方法时，不需要重复此项工作。 对金属创新的色谱法，必须确定其特异性，如使用质谱法，则可由谱带来推断。实际被测定物质的种类应在提交仲裁时阐明，如果不可能，必须解释其理由，供讨论时考虑。 答案补充 4．注意事项
（1）检测系统响应的线性范围通常由所用仪器决定，方法使用不同系统时，应重新验证线性范围。
（2）如提交方法的性能指标低于准则中规定的Z小数值，则必须提出充分理由，解释为何使用此方法。
（3）对方法确证有用的其他数据亦应提出，如再现性的评价（由协作研究获得）或为使方法完善而有微小变动的报告。
（4）对多种制剂适用性的确认数据：确认数据一般为针对某一特定的制剂，但制造商可能生产许多类似的制剂，并可能使用同一分析方法，其交互使用规则为： ①制剂中应含有相同（或很类似）助剂，改变助剂性质时，应检验可能的干扰。 ②制剂在物理化学性能上不应有显著区别（如P”值）。 ③在测定溶液中，有效成份浓度必须保持在标明的线性范围内。 ④有关助剂浓度的任何变化，不应产生明显干扰。 提交进行交互使用的方法，应考虑以上几点。（5）提出确认的任何方法，只能使用经过认证过的参比物质（或来源于参比物质）作为标准品， 答案补充 本要求不适用于内标物。 5．参考和使用文献（略） ［附件1」重复性可行性的Horwitz公式 本公式由Horwitz等人根据AOAC多年来多次协作研究结果，认为可行而确定。适用于本文件的下述实例浓度范围是0．25％～100％。 公式％RSDR＝ 2（1－0.51og.c） 式中％ RSDR是实验室间的变异系数（CV），
C是样品中被分析物的浓度，以小数计。因此100％的纯样品，则C＝1，logC＝0，
故％RSDR＝2（1－（0.5 X 0））＝21－2；
答案补充 50％的样品（如500克／千克可湿性粉剂），则C＝0.5，logC＝-0.3010，故％RSDR＝2（1一0.5 X（一0.3010））＝21.1505＝2．22； 其他数值为：
20％，％RSDR＝2．55；10％，％RSDR＝2．83；5％，％RSDR＝3．14；2％，％RSDR＝3．60；l％，％RSDR＝4．00；0．25％，％RSDR＝4．93。
Horwitz注意到RSD，（重复性变异系数）通常为RSDR的1／2和2／3之间，为此重复性的变异系数即X 0．67。 根据以上数值，可能得出如下结果：被分析物％ Horwitz RSDR 建议的 RSDY 100
2 1.34 50 2.22 1.49 20 2.55 1.71 10 2.83 1.90 5 3.14
2.10 2 3.60 2.41 1 4.0 2.68 0.25 4.93 3.30
未经修改的Howrwitz上式是CIPAC协作研究试验方法可行性的依据。 ［附件Ⅱ」准确度评价
答案补充 下列步骤阐明评价方法准确度的各种途径： (1）一种方法的准确度，可以从测定已知分析物含量的大量“样品”的结果获得。这些样品由实验室制备，加入已知量的分析物（其数量根据方法要求）并带有助剂的混合物。加入的被分析物必须是已知有效成份含量的原药。在分析样品过程中应消除取样误差，并严格按照提出的方法，至少测定4个回收率，测得的数据可用下列办法处理： ①计算回收率平均值和回收率的相对标准偏差。 ②对这些结果和评价重复性的结果进行F检验，以确定回收率结果的RSD与评价精密度结果之间无显著差异。 ③如能达到②项对回收率结果可用Student
t检验，其目的是为证明获得回收率（平均值）与加入浓度之间差异仅仅是由于偶然误差（无明显的系统误差）。 |T|＝|（ω－μ）n／S|
X＝样品平均值，μ＝真值，n＝样品数量，S＝标准偏差。t在不同自由度（n－1）的临界值在一般的统计表中列出。如果算得的t值未超过临界值。证明在给定的置信区间（95％即可）没有显著系统误差。 答案补充 （2）上述表达式可再整理为平均数的置信区间，可定为一个范围，样品的真值是在此范围内（在给定的置信度）
μ＝X±t（∫s/n）自配的制剂平均回收率的计算如下： 平均回收率（％）＝测定含量的平均值％X
100／理论含量％ 平均回收率应在以下的范围内： 有效成份标明值％ 平均回收率％ ＞10 980～102．0
1～10 97．0～103．0 ＜1 95．0～105．0 （3）对上述两种情况，本消除取样误差必须分析一种完全自配制剂。相同步骤也可用于已知成份混合物的子样品分析，但必须注意，在取样时如制剂样品不均匀，则将使平均数的置信区间数值人为增大。 （4）当分析样品很难获得重复结果的制剂（如九粒或块状饵料），可通过添加标准品的方法来计算准确度。在这种情况下，必须提交如何添加标准品的细节报告。